提高三角酵母细胞DAO表观活力的透性化研究

三角酵母(Trigonopsis variabilis)的D-氨基酸氧化酶(D-amino acid oxidase,DAO,EC1.4.3.3)是一种胞内酶,完整细胞并不呈现酶促活性。为了获得三角酵母细胞的较高表观活力,需对细胞进行处理以改变壁和膜对反应底物和产物的通透性。研究中比较了冻融、丙酮、丁醇和十六烷基三甲基溴化铵(Cetyltrimethylammonium bromide,CTAB)等理化因子的透性化效率,并对丙酮的透性化条件进行了优化。证明丙酮的透性化作用与溶剂浓度、保温时间和温度有关。30%～35%丙酮浓度,4～28℃保温,可得到最大酶活力。透性化所需时间极短,在5min内即可完成。同时,透性化细胞中的DAO比无细胞抽提液中的酶对热更为稳定。用丙酮透性化细胞作为生物催化剂可有效地转化头孢菌素C(Cephalosporin C, CPC)为戊二酰-7ACA(Glutaryl-7-ACA,GL-7ACA)。     

展望即将到来的“分子农业”

在过去20余年里,植物生物技术领域中最值得重视的是多种转基因植物的建成,并已在一些国家大面积种植。转基因植物另一方面的进展是合成有医疗价值的多肽、蛋白质、包括抗体、抗体表位、复杂蛋白质等。这里主要介绍转基因植物生产的医疗用多肽、蛋白质,特别是作为口服疫苗在动物和临床试验的成功,预示这种新的用药途径将对第三世界人民的健康起到重大作用。由于转基因口服疫苗不需通过常规发酵反应器,仅仅依赖于农业,因此有人提出“分子农业”一词,以显示其优越性。     

林肯链霉菌合成林可霉素代谢调节的研究

在摇瓶条件下研究了葡萄糖、铵盐、磷酸盐对林可霉素产生菌林肯链霉菌的生长及林可霉素生物合成的影响。发酵过程中林可霉素的合成主要发生在菌体生长期,逐渐下降。使用6%的葡萄糖未发现通常所说的“葡萄糖效应”。0.2%铵盐有利于细胞生长,但0.8%NH+4对林可霉素的生物合成具有抑制作用。发酵48h后补加0.6% NH^＋_４,对林可霉素的生成没有显著影响。0.05%～0.1%磷酸盐对林可霉素合成具有较强的抑制作用。并就磷酸盐对菌体由初级代谢转向次级代谢的作用作了初步考察。     

林肯链霉菌谷氨酸合酶的纯化和性质

采用硫酸铵分级沉淀、离子交换层析、凝胶过滤和吸附层析等方法 ,分离纯化了林肯链霉菌谷氨酸合酶 ,电泳鉴定为单一组分 .这是链霉菌中的第 1例 .谷氨酸合酶很不稳定 ,向酶缓冲液中加入α -KG ,PMSF ,EDTA ,β 巯基乙醇和甘油可以大大提高其稳定性 .测得全酶分子量为 1 38ku ,亚基分子量为 81和 5 7ku ,表明该酶由2个不相同的亚基构成 .吸收光谱在 380和 440nm附近没有吸收峰 ,表明该酶是不含铁的非黄素蛋白质 .该酶反应的最适 pH为 7 .2 ,最适温度为 30℃ .该酶对NADH ,α KG和L -Gln的表观Km 值分别为 5. 2 1× 1 0 ^-5 ,4. 1 7× 1 0 ^-4 和 4. 35× 1 0 ^-4 mol/L .以NADPH代替NADH作电子供体 ,该酶仍表现出部分活力 .反应产物Glu和NAD⁺,部分金属离子、氨基酸及三羧酸循环中间物对该酶活力有不同程度的抑制作用 .     

GL一7一ACA酰化酶基因片段的酶谱分析及基因定位

本文报道了从假单胞菌130菌株(Pseudomonas sp．130)染色体上克隆得到的6．8kb的GL－7－ACA酰化酶基因片段的限制酶谱,基因定位以及在不同的大肠杆菌基因启动子控制下酰化酶基因的表达水平。结果表明,所克隆的片段上,不存在EcoR Ⅰ、HindⅢ、claⅠI切点,分别具有一个HpaⅠ、两个xhoⅠ、三个BamHⅠI以及四个Pst I切点,同时初步确定了这些酶切位点之间的相对位置。经过一系列次级克隆研究,GL一7一AcA酰化酶基因已被定位在3．Okb的B 2－B3－Hpa Ⅰ片段上。实验比较了以pACYCl84、pDR540、pUCl9等为载体的次级克隆株(分别为pMR9、pMRl0和pMR11)在大肠杆菌中酰化酶基因的表达水平,测定数据表明tac启动子的启动活力比tet启动子强,即pMRl0的产酶量比pMR9高一倍,而当tac启动子前再串接一个lac启动子时(pMRll),产酶水平并不进一步提高。本文还对假单胞菌基因在大肠杆菌中的表达进行了讨论。     

丙氨酸对热带假丝酵母NPcoN22长链二元酸发酵的调节

本文研究了丙氨酸对热带假丝酵母(Candida tropicalis)NPcoN22长链二元酸发酵的调节,并把它与尿素的调节作了比较。在蔗糖利用、烷烃利用、菌体生长、发酵液pH变化和十四烷一1,14一二羧酸积累诸方面以及在三羧酸循环、乙醛酸循环、过氧化氢酶等酶的活力方面,丙氨酸具有与尿素相同的调节作用。丙氨酸加尿素作为混合氮源或在正常发酵过程中补加尿素或丙氨酸,其调节效果与过量尿素或过量丙氨酸单独存在条件下的情况一样,说明尿素和丙氨酸的调节作用具有相加效应。发酵过程中菌体对丙氨酸的利用特点表明了丙氨酸是菌体生长的限制因子。Β一氧化的抑制剂——丙烯酸能显著提高十四烷一1,14-二羧酸的积累。     

芳香途径终产物和中间体对力复霉素SV生物合成的调节作用

本文报道了芳香化合物对力复霉素生物合成和芳香途径开始的DAHP合成酶活力的调节作用。首先,洗涤菌体实验结果指出,色氨酸对力复霉素sV合成有明显抑制,苯丙氨酸和酪氨酸本身作用不明显。其次,酶活力测定结果表明,色氨酸抑制力复霉素生物合成是由于它对DAHP合成酶的反馈抑制;同时,在无细胞抽出液中酪氨酸和苯丙氨酸对色氨酸抑制也显示了协同作用。此外,力复霉素芳香前体(C7N)的结构类似物对氨基苯甲酸和对羟基苯甲酸对抗生素合成也有影响,主要影响c,N的生物合成。     

力复霉素生物合成中间体A-32的生物学特性与结构的研究

本文报道了地中海诺卡氏菌Nocardia mediterranei经诱变育种获得的两株无活力菌株(rifl、nf2),能经共合成产生力复霉素,即其中供体菌株r·fl,在发酵液中累积一个中间体A一32,能被另一个无活力菌株nf 2转化为力复霉素[1,2]。此中间体(A一32)经分离纯化,理化性质和生物活性研究以及lR、NMR、Ms的光谱测定,确证A一32结构为3一羟基5氨基苯甲酸(简称A一32),这与Kibby等[3]推测中间体C,N的化学结构是相同的物质,从而证明了化合物C,N是力复霉素的一个天然中间体．     

头状轮生链霉菌中丝裂霉素C抗性基因的克隆及功能研究

头状轮生链霉菌(\%Streptoverticillium caespitosus\%)ATCC27422是抗肿瘤药物丝裂霉素的主要产生菌,实验通过诱变筛选获得不产生丝裂霉素同时对丝裂霉素C敏感的阻断变种S6,并以它为受体宿主,以质粒pIJ699为载体,建立野生型头状轮生链霉菌菌株ATCC27422的基因库。采用鸟枪法克隆技术,从库中筛选获得含有丝裂霉素C抗性基因的62kb外源片段的克隆子。将含此外源片段的质粒pLX5导入变铅青链霉菌(\%Streptomyces lividans\%)获得表达。并且首次成功地运用电穿孔法将pLX5导入野生型菌株中,使其对丝裂霉素C的抗性大幅度提高：最低抑制浓度(MIC)由原来的200μg/mL上升至1000μg/mL以上。摇瓶发酵实验表明：单位菌量的ATCC27422(pLX5)的丝裂霉素产量高于野生菌株ATCC27422,因此丝裂霉素C抗性与产量之间存在一定的相关性。