XJ-160病毒复制子型表达载体的构建

XJ-160病毒是我国首次分离的辛德毕斯病毒,全基因组测序已经完成.本文利用该病毒全基因序列首先构建了全基因组cDNA克隆质粒,在此基础上,利用基因重组技术将病毒结构基因序列替换为含有多个单酶切位点的序列,得到复制子表达载体质粒pRepxj160.为验证载体的功能,将报告基因绿色荧光蛋白(EGFP)和β-半乳糖苷酶基因(lacZ)分别插入到载体的多克隆位点,得到两个表达质粒;经体外转录获得的转录体RNA转染BHK-21细胞后14h,可检测到报告基因的表达.结果表明我们构建的XJ-160病毒复制子型表达载体具有自主复制功能,可以表达异源基因.本研究为进一步开发具有我国自主知识产权的甲病毒载体奠定了基础.     

环介导逆转录等温扩增技术(RT-LAMP)在丙型肝炎病毒基因检测中的应用

该文介绍了一种便捷、灵敏而又特异的环介导逆转录等温扩增基因检测技术,该技术分别使用特异对应于靶序列中8个基因区段的3对特殊引物,并在反转录酶和Bst-DNA聚合酶的作用下对靶序列进行等温核酸扩增反应,整个检测反应只需1~2h。利用这种技术成功检测了丙型肝炎病毒基因,对60份经Real-time PCR或RT-PCR验证阳性的血清样品检测,阳性符合率为98%。同时,对扩增终产物进一步进行酶切分析,并与HIV、HBV和不同亚型流感病毒RNA进行交叉反应和特异性测试,均与预期结果吻合。将Real-time PCR定量后的RNA系列稀释后对检测方法的灵敏度进行了测试。结果显示,该技术的检测灵敏度在理论上可达到10个拷贝的RNA分子。以上结果证明,RT-LAMP扩增技术是一种检测程序简单、灵敏度和特异性较高的基因检测手段,在丙型肝炎病毒的快速检测方面具有一定的开发潜力。     

国际干扰素及其他细胞素研究协会1994年年会简介

国际干扰素及其他细胞素研究协会１９９４年年会简介侯云德（中国预防医学科学院病毒学研究所,北京１０００５２）国际干扰素及其他细胞素研究协会（ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎａｎｄＣｙｔｏｋｉｎｅＲｅｓｅａｒｃｈ─ＩＢＩ...     

人γ干扰素（IFN－γ）－表皮生长因子（EGF）融合蛋白的抗肿瘤细胞增殖作用与靶细胞的EGF受体有关

采用表皮生长因子（ＥＧＦ）受体丰富的Ａ４３１细胞进一步研究了人ＩＦＮ－γ－ＥＧＦ３融合蛋白￣〔１〕的抗细胞分裂活性,以及它和靶细胞ＥＧＦ受体的关系。结果表明,ＩＦＮ－γ－ＥＧＦ３融合蛋白的抗肿瘤细胞增殖作用明显高于其母体分子。￣１２５Ｉ－ＥＧＦ受体竞争抑制试验表明,ＩＦＮ－γ可与ＥＧＦ竞争Ａ４３１细胞的ＥＧＦ受体,而ＩＮＦ－γ－ＥＧＦ３融合蛋白的ＥＧＦ受体竞争抑制作用更为明显,说明人ＩＦＮ－γ和ＩＦＮ－γ－ＥＧＦ３融合蛋白的抗肿瘤细胞分裂活性,与靶细胞ＥＧＦ受体被竟争抑制密切相关。     

在大肠杆菌中反义RNA抑制乙型肝炎病毒核心抗原的表达

将乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)基因的DNA序列分别按正、反方向置tac启动子的控制下,并克隆进入同一个质粒中,转化大肠杆菌JM103后,观察到HBcAg和HBeAg的合成均明显低于仅含有HBcAg基因的细菌,最大抑制率可达70％～80％,分子杂交可见反义RNA存在。     

直组人嗜中性白细胞活化蛋白-1/白细胞介素-8的纯化与鉴定

本文利用SDS-PAGE及蛋白质电泳印迹技术,从带有相应表达质粒的重组大肠杆菌裂解液中,将所表达的重组人嗜中性白细胞活化蛋白-1/白细胞介素-8(NAP-1/IL-8)转移至聚偏二氟乙烯膜上,直接进行N-末端15个氨基酸的序列分析,从而确证该目标蛋白得到高效表达和正确加工。随后采用Bio-Gel P30凝胶过滤层析和Mono-S阳离子交换层析对重组人NAP-1/IL-8进行了分离纯化,纯化产品达到SDS-PAGE纯。利用琼脂糖平板法测定了纯化产品的嗜中性白细胞趋化活性,推算其比活为2.8×10~5U/mg蛋白。又利用SDS-PAGE测出重组NAP-1/IL-8的分子量约为8.5kD,但根据凝胶过滤层析的洗脱时间推定,在溶液中确实存在分子量稍大于14.4kD的NAP-1/IL-8二聚体。     

The complete genomic sequence of egg drop syndrome virus strain AAV-2

In the search for the genome of egg drop syndrome virus (EDSV-76) Chinese strain AAV-2, part of restrietion endonuclease physical map is analyzed, the complete genomic library is organized. On basis of this, the eomplete genome nueleotide sequences (32 838 bp in length, including terminal structures) are determined. The data analysis shows: compared with the other Adenoviruses, strain AAV-2 has more disparity on ganomic structure and the distribution of open reading frame (ORF). There are no elear E1, E3 and F4 regions in AAV-2 genome. Two segments located at both ends of genome (1.1 kb and 8.3 kb in length respectively) have no homology with the other adenovirus genomes. In addition, strain AAV-2 genome lacks ORFs encoding E1A, pⅤ and pⅨ, which are common ORFs encoding early, lately proteins in Adenovirus. This reveals differences between EDSA-76, the sole standard strain of group Ⅲ Avian Adenoviruses, and the other Avian Adenoviruses for the first time. It will help the search for Avian Adenovirus     

表达产物可用IMAC快速纯化的原核表达载体的组建与应用

以原核高效表达载体pBV,220为骨架载体,采用互补寡核苷酸插入法在pBV220多克隆位点的上游插入了起始密码子和6组氨酸编码序列,将此新质粒命名为pBV222,以此载体表达的目的蛋白在N-段带有His6尾以利于IMAC层折快速纯化目的蛋白,酶切及核苷酸序列分析验证了我们的设计。将IL-2和GM—CSF cDNA克隆入pBV222载体中,表达的目的蛋白与预期的分子量相同,表达产物以包涵体的形式存在,表达量比非融合蛋白有明显的提高。且这种融合蛋白保留GM-CSF的生物学活性。表达菌体直接用6mol／L盐酸胍裂解或首先分离包涵体之后盐酸胍裂解,上清直接IMAC层析,以阶段性或线性pH梯度洗脱特异的目的蛋白。SDS-PAGE分析蛋白纯度在90％以上。     

脑啡肽-αⅠ干扰素的镇痛作用和抗肿瘤作用

从大肠杆菌工程菌中纯化脑啡肽-αⅠ干扰素融合蛋白,测定其在小鼠脑内的镇痛作用,阿片受体结合功能及对肿瘤细胞生长抑制和体内抗肿瘤作用.结果显示,与αⅠ干扰素母体相比,融合蛋白具有较强的镇痛作用, 镇痛作用可为腹腔注射阿片受体拮抗剂Naloxone和Naltrindole 反转, 融合蛋白可竞争³H标记σ型阿片受体配基DPDPE与膜受体结合.融合蛋白的肿瘤细胞生长抑制和体内抗肿瘤作用也高于母体分子, 说明脑啡肽和αⅠ干扰素的融合蛋白实现并增强了脑啡肽-αⅠ干扰素融合蛋白的双重功能.