泛素、泛素链和蛋白质泛素化研究进展

蛋白质泛素化是以泛素单体和泛素链作为信号分子,共价修饰细胞内其他蛋白质的一种翻译后修饰形式。不同蛋白质底物、同一底物的不同氨基酸修饰位点以及同一位点上泛素链连接方式的不同均可导致细胞效应的差异。蛋白质泛素化在真核细胞内广泛存在,除了介导蛋白质的26S蛋白酶体降解途径之外,还广泛参与了基因转录、蛋白质翻译、信号传导、细胞周期控制以及生长发育等几乎所有的生命活动过程。泛素链的形成及其修饰过程的任何失调均可导致生物体内环境的紊乱,从而产生严重的疾病。文中结合实验室研究,综述了泛素的发现历史、基因特点、晶体结构,特别是泛素链的组装过程、结构、功能以及与人类相关疾病关系的新进展,可为这些疾病的治疗靶点和药物靶标的研究提供思路。     

CRL4在增殖的肝细胞系中上调乙型肝炎病毒抗原的分泌表达

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）编码的X蛋白（hepatitis B virus X protein,HBx）对HBV感染的起始和维持至关重要。HBx可能作为病毒来源的接头分子,介导Cullin-RING E3泛素连接酶4（cullin-RING ubiquitin E3 ligase 4,CRL4）复合物对染色体外DNA限制因子SMC5/6的降解。最近研究发现CRL4接头分子DNA损伤结合蛋白1（DNA damage-binding protein 1,DDB1）可不依赖与HBx的相互作用而直接上调病毒的表达和复制。本研究基于HBx基因删除（X-null）的HBV重组cccDNA（recombinant covalently closed circular DNA,rcccDNA）模型系统,在多种体外培养肝细胞系中证实上述发现。有意思的是,CRL4刺激rcccDNA^X-null转染细胞抗原分泌表达的效应能被血清饥饿实验抵消。应用尾静脉高压注射小鼠模型,同样发现CRL4并不上调rcccDNA^X-null在非增殖小鼠肝脏细胞中的表达。以上结果提示,细胞增殖特征与CRL4不依赖HBx上调病毒抗原表达的效应密切相关,有助于HBx生物学意义的准确分析和理解。     

植物泛素/26S蛋白酶体途径的研究进展

泛素/26S蛋白酶体途径（ubiquitin/26S proteasome pathway,UPP）是目前已知最有效的、最具特异性的蛋白质降解途径。该途径介导了真核生物80%-85%的蛋白质降解,参与了细胞多项生命活动过程,对于维持细胞正常生理功能具有重要意义。研究结果表明,植物生长发育的诸多方面以及干旱胁迫响应等过程都受到该途径的调控。概述了泛素/26S蛋白酶体途径及其在植物生长发育过程中的作用,并着重阐述了由泛素-蛋白连接酶E3介导的植物干旱胁迫响应及其作用机制的研究进展。     

眼镜王蛇泛素融合蛋白基因和核糖体蛋白L30基因的克隆及分析

从广西产眼镜王蛇（Ophiophagus hannah）毒腺中抽提总RNA,经mRNA纯化后构建眼镜王蛇毒腺cDNA文库。从所构建的cDNA文库中,随机筛选200个克隆测序,得到两个在进化上高度保守的基因：泛素融合蛋白基因（GenBank登录号为AF297036）和核糖体蛋白L30基因（GenBank登录号是AF297033）。前者cDNA的开放阅读框为387bp,后者为348bp。前者编码128个氨基酸残基组成的泛素融合蛋白前体;后者编码115个氨基酸残基组成的核糖体蛋白L30前体。由cDNA序列推导出的氨基酸序列分析表明,泛素融合蛋白前体包括N-末端的泛素结构域（76个氨基酸残基）和C-末端的核糖体蛋白L40结构域（52个氨基酸残基）。该蛋白为一高碱性蛋白,C末端含有一个“锌指”模式结构。与16个物种比较的结果表明,眼镜王蛇与脊椎动物的泛素融合蛋白氨基酸序列相似度较高,具有高度的保守性。     

花粉特异F-box基因及其表达产物可能参与的SCF途径

泛素蛋白体目标性降解蛋白途径是许多细胞学过程的重要调节体系,底物蛋白泛素化涉及3个酶激反应,其中,作为E3连接酶的SCF复合体对底物的识别是通过亚体F-box蛋白C末端的特异性结构实现的.利用染色体步移等方法,最近在一些配子体型自交不亲和植物S-RNase基因近旁相继发现了一类花粉特异性表达的F-box基因,从而预示泛素介导的SCF蛋白降解途径可能参与配子体自交不亲和反应.     

SCF泛素连接酶靶蛋白识别组分FBW7

FBW7（F-box and WD repeat domain-containing7）是F-box蛋白家族成员,为SCF（SKP1-CUL1-F-box）型泛素连接酶的靶蛋白识别组分。FBW7通过靶降解周期蛋白E、Myc、Jun等多种癌蛋白,对细胞周期进程、细胞生长、分化起重要调控作用。在多种人类肿瘤中已发现FBW7突变,FBW7功能缺失会引起染色体不稳定及肿瘤发生,表明FBW7是一种肿瘤抑制因子。在FBW7缺失所致的肿瘤发生过程中,周期蛋白E、Myc等靶蛋白活性升高、p53功能缺失有重要作用。     

小鼠泛素结合酶UBE2W的抗体制备及组织表达谱分析

泛素结合酶(E2)是蛋白泛素化修饰所需的第二个连接酶, 在泛素转移和底物特异性识别过程中发挥着重要作用。UBE2W是一种新发现的E2酶, 其果蝇属同源蛋白可能在光转导或视网膜变性过程中发挥作用, 鼠和人同源蛋白功能未见报道。生物信息学分析UBE2W鼠源氨基酸序列, 发现UBE2W具有典型的UBC结构域并在多种物种高度保守。通过构建UBE2W原核表达质粒, 在大肠杆菌中表达并纯化了GST-UBE2W融合蛋白。以此纯化蛋白作为抗原免疫新西兰白兔制备抗UBE2W多抗血清, 并利用制备的UBE2W抗原柱亲和纯化UBE2W多抗。为了检测纯化抗体特异性, 在真核细胞中瞬时表达了myc-UBE2W融合蛋白, 分别用myc单抗和UBE2W多抗进行Western blotting分析, 结果表明获得了特异性的UBE2W抗体。利用此特异性抗体在小鼠脑、心脏、肾脏、肝脏、肺、肌肉、脾脏和睾丸等组织中均检测到了UBE2W的表达, 且在小鼠睾丸中成年期表达最高。     

甜菜夜蛾核多角体病毒泛素基因的克隆及原核表达

甜菜夜蛾核多角体病毒（Spotoptera exigua multi-nucleopolyhedrovirus,SeMNPV)泛素基因ubiquitin被克隆和序列分析,该基因编码区全长243bp,编码80个氨基酸残基,预计蛋白质分子量为9.4kDa。将这一ubiquitin基因克隆到原核表达载体pET-28a上,转化至BL21（DE3）中,用IPTG进行诱导表达,对表达的条件进行优化,用异源的泛素单克隆抗体检测目的蛋白,Western blot 实验证明所表达的蛋白是泛素蛋白。同时,我们制备了特异性的抗体,为以后的研究工作做了基础,通过计算机软件Gendoc对不同来源的泛素进行分析,结果显示,病毒中的泛素与真核细胞中的泛素相比较,泛素的氨基酸序列有较大的变化,杆状病毒的深入素基因在分子进化上可能有比较独特的途径。     

斜纹夜蛾泛素基因的克隆及表达

泛素介导的蛋白质降解途径对脑内蛋白的选择性降解起着重要作用。设计一对简并引物,从斜纹夜娥(Spodoptera litura)细胞中克隆了泛素基因的编码区,CenBank登录号AF436066。序列分析表明,该编码区的长度为228bp,编码由76个氨基酸组成的、分子质量为8．56kD的蛋白,其等电点为6．56。同源性比较发现,斜纹夜峨泛素基因不仅与其它真核生物的泛素基因在氨基酸水平上具有96％以上的相似性,而且与斜纹夜蛾核多角体病毒(SpltMNPV)泛素基因的同源性为84％。RT—PCR分析发现,泛素基因在所检测的斜纹夜蛾幼虫多种组织,尤其是脂肪体中均有表达。采用构建的原核表达载体pQEUB,在大肠杆菌M15中诱导并高效表达出了带有His—tag的重组融合蛋白,薄层扫描分析得知靶蛋白约占总蛋白的37％。利用Ni—NTA亲和层析胶纯化得到重组融合蛋白,经SDS—PAGE鉴定为单一区带,为进一步研究S．litura泛素在SpltMNPV感染中的作用打下了基础。     

APP/PS1转基因鼠脑内小泛素化修饰物-1上调可能参与阿尔茨海默病老年斑形成和神经突起变性的调节北大核心CSCD

小泛素化修饰物(small ubiquitin-related modifier,SUMO)是一类重要的类泛素蛋白,研究显示一些神经退行性疾病相关蛋白可以被SUMO化修饰。本文旨在观察APP/PS1转基因阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)鼠中SUMO-1表达及修饰的变化,并探讨SUMO-1与AD病理的关系。采用免疫印迹的方法检测12月龄的APP/PS1转基因AD鼠脑内SUMO-1表达及修饰的变化,同时用免疫共沉淀及免疫荧光的方法研究AD鼠脑内SUMO-1与tau、APP和Aβ的关系。结果显示:(1)与正常野生型小鼠相比,AD鼠脑内SUMO-1表达及其修饰的蛋白增加,同时伴有泛素化蛋白的增加;(2)AD鼠大脑皮层的RIPA可溶蛋白组份中,SUMO-1修饰的tau增加,而AT8抗体识别的磷酸化tau的SUMO-1修饰减少,但422位点磷酸化tau的SUMO-1修饰没有明显改变;(3)SUMO-1与磷酸化tau、APP及Aβ免疫荧光双标显示,在AD鼠脑内SUMO-1可在老年斑的中部和周围分布,并且SUMO-1与AT8识别的磷酸化tau在老年斑周围的变性神经突起中有相对较多的共存,但与APP、PS422识别的磷酸化tau和Aβ的共定位很少。以上结果提示,SUMO-1在APP/PS1转基因AD小鼠脑内表达增加,并可能参与变性神经突起及老年斑形成的调节。