构建酿酒酵母细胞工厂高效合成摩尔酸

[目的] 摩尔酸作为齐墩果烷型三萜化合物具有抗HIV、抗炎等多种生物学活性,其前体物质是计曼尼醇,本研究基于合成生物学策略构建酿酒酵母细胞工厂高效合成摩尔酸。[方法] 运用CRISPR/Cas9技术,首先分别整合不同来源的氧化鲨烯环化酶（OSCs）,筛选高产计曼尼醇底盘细胞;进一步异源表达长春花来源的细胞色素P450氧化酶（CYP716AL1）和麻风树来源的细胞色素P450还原酶（JcCPR）,构建摩尔酸生物合成途径;并通过CYP716AL1和不同来源的CPR适配研究以及过表达甲羟戊酸（MVA）代谢途径中关键酶的方式提高摩尔酸的产量。[结果] 整合苹果来源的氧化鲨烯环化酶MdOSC获得的重组菌株计曼尼醇产量最高,达68.3 mg/L;以此为底盘细胞进一步整合CYP716AL1和JcCPR实现了摩尔酸的生物合成,产量为15.0 mg/L;共表达CYP716AL1和拟南芥来源的CPR获得的重组菌株摩尔酸产量最高,达到24.3 mg/L;最后过表达MVA代谢途径中的关键酶法呢基焦磷酸合酶（ERG20）和鲨烯环氧酶（ERG1）,获得的重组菌株摩尔酸产量高达34.1 mg/L。[结论] 本研究实现了摩尔酸的高效生物合成,为构建高产齐墩果烷型三萜酿酒酵母细胞工厂提供了理论和技术依据。     

基于多酶级联协调表达策略高效催化合成 (S)-2-羟基丁酸

2-羟基丁酸 (2-hydroxybutyric acid,2-HBA) 是合成生物可降解材料和各种药物的重要中间体,化学法合成的外消旋2-HBA需要去消旋才能获得光学纯对映异构体,应用于工业。文中通过在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3) 中共表达苏氨酸脱氨酶 (Threonine deaminase,TD)、l-乳酸脱氢酶 (l-lactate dehydrogenase,LDH)和甲酸脱氢酶 (Formate dehydrogenase,FDH),构建 (S)-2-HBA的合成途径及其辅因子NADH的循环系统,实现了基于三酶级联反应催化底物l-苏氨酸合成 (S)-2-HBA。为了解决多酶级联催化反应中中间产物2-酮丁酸的生成速率和消耗率不匹配的问题,文中通过启动子工程策略来调控TD和FDH的表达水平,获得了多酶催化速率平衡的重组大肠杆菌P21285FDH-T7V7827。在5 L发酵罐水平,全细胞催化反应16 h,(S)-2-HBA的最高产量为143 g/L,摩尔转化率为97%,为迄今报道的最高产量的1.83倍,使其具有较强的工业化应用潜力。此外,结果表明,在单细胞中构建可调节的多酶协调表达系统对生物催化制备羟基酸类化合物具有重要意义。     

亮氨酸脱氢酶C端Loop区域的理性设计及多酶级联高效合成l-2-氨基丁酸

亮氨酸脱氢酶 (Leucine dehydrogenase,LDH) 是制备l-2-氨基丁酸的关键限速酶,针对该酶的Loop区域进行改造以提高关键酶的酶活及稳定性从而高效合成l-2-氨基丁酸。通过亮氨酸脱氢酶的分子动力学模拟分析均方根涨落 (Root mean square fluctuation,RMSF) 值,对其波动非常明显的Loop区域合理设计以得到比酶活提高的截短突变体EsLDHD2,其比酶活为野生型的123.2%;此外,由于l-2-氨基丁酸制备过程中苏氨酸脱氨酶催化l-苏氨酸制备2-酮丁酸的速率过快导致多酶催化不平衡,因此双拷贝亮氨酸脱氢酶及甲酸脱氢酶以平衡多酶催化速率,构建多酶级联催化的单细胞E. coli BL21/pACYCDuet-RM,其摩尔转化率相较于E. coli BL21/pACYCDuet-RO提高74.6%;对菌株E. coli BL21/pACYCDuet-RM的全细胞转化条件进行优化,其最适pH、温度、底物浓度分别为7.5、35 ℃和80 g/L,此时摩尔转化率大于99%;在1 L转化体系和最适转化条件下分批加入l-苏氨酸80 g和40 g,l-2-氨基丁酸的产量达97.2 g。总之,该策略为l-2-氨基丁酸的制备提供了绿色、高效的合成方法,具有工业化制备药物前体的巨大潜力。     

代谢改造重组谷氨酸棒杆菌C4途径高效合成5-氨基乙酰丙酸

5-氨基乙酰丙酸 (5-aminolevulinic acid,5-ALA) 在医药和农业等领域有着广泛作用,目前主要采用大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌以微生物发酵法合成。为了进一步提高谷氨酸棒杆菌合成5-ALA的能力,对其C4代谢途径进行了系统代谢改造。首先分别在谷氨酸棒杆菌中异源表达荚膜红杆菌和沼泽红假单胞菌的5-氨基乙酰丙酸合成酶ALAS,选择酶活相对较高的沼泽红假单胞菌的RphemA基因作为关键合成酶基因,并筛选到能显著增强RphemA的酶活性的核糖体结合位点RBS5。重组菌株ALAS的比酶活可达 (221.87±3.10) U/mg,且5-ALA产量提高了14.3%;随后通过敲除α-酮戊二酸脱氢酶抑制蛋白基因 (odhI) 和琥珀酸脱氢酶基因 (sdhA),促进了前体琥珀酰CoA向5-ALA途径的流动;通过sRNA抑制hemB表达减少了5-ALA的降解;并且过表达半胱氨酸/O-乙酰丝氨酸转运蛋白eamA提高了5-ALA的输出效率;使用重组菌株C. glutamicum 13032/?odhI/?sdhA-sRNAhemB-RBS5RphemA-eamA摇瓶发酵,5-ALA最高产量达11.90 g/L,较出发菌株提高了57%。最后,在5 L发酵罐中进行补料分批发酵,48 h内5-ALA的产量达25.05 g/L,为目前以葡萄糖为碳源发酵的最高产量。本研究构建了高产5-ALA重组谷氨酸棒杆菌,具有良好的工业应用前景。     

大肠杆菌抗噬菌体基因的挖掘及其抗噬菌体菌株的构建

【目的】噬菌体是工业发酵侵染底盘细胞的专一性病毒，由于其广泛存在以及难以根除，极大影响了发酵生产，从基因水平进行抗噬菌体基因的挖掘以及功能验证可以显著增强底盘细胞的抗噬菌体的能力，从而达到从源头上抵御噬菌体污染的目的。为了选育具有噬菌体抗性的工程菌株，本研究旨在分析选取抗噬菌体的基因以及构建抗噬菌体的工程菌株。【方法】采用共进化筛选、重测序手段、重组菌株构建以及噬菌体侵染的敏感验证实验等方法，获得具有抗噬菌体属性的工程菌株。【结果】实验通过共进化共筛选得到7株抗噬菌体驯化菌株，基因组重测序以及Annovar软件分析，发现了12个基因发生位点突变，选取位点突变频率较高的dnaE (DNA聚合酶III亚基α)、yhjH (环状二GMP磷酸二酯酶)及rzoD (假定的噬菌体裂解脂蛋白) 3个基因分析对噬菌体的抗性，突变基因过表达菌株对噬菌体BL21 Virus 01、BL21 Virus 02、BL21 Virus 06、T1和T7具有明显的抗性；吸附率测定结果表明，基因dnaE和yhjH影响噬菌体复制，而基因rzoD突变影响噬菌体吸附过程。使用定量PCR进一步分析突变基因dnaE和yhjH对噬菌体的抗性作用，结果表明基因dnaE、yhjH突变影响噬菌体基因组BL21 Virus 01的复制过程，而rzoD突变影响噬菌体BL21 Virus 01的吸附过程。【结论】基因dnaE、yhjH、rzoD的位点突变能够有效抵御噬菌体的侵染，同时含有3个位点突变的工程菌株BC11具有较广范围内的噬菌体抗性，是潜在的抗噬菌体底盘细胞。本研究为抗噬菌体基因挖掘与初步解析以及开发抗噬菌体工程菌株提供借鉴。