白念珠菌几丁质合成酶三维结构的同源建模及其与FR-900403的分子对接研究CSCD

目的探究白念珠菌几丁质合成酶活性位点的结构特征。方法通过采用同源建模的方法首次构建白念珠菌几丁质合成酶的三维结构模型,模型的可靠性经Ramachandran和Profile-3D图进行验证。采用InsightⅡ-Binding site方法准确定位几丁质合成酶的活性位点,并研究了几丁质合成酶的重要功能残基在活性位点的立体分布。结果通过柔性分子对接方法首次阐明几丁质合成酶抑制剂FR-900403与靶酶活性位点的相互作用模式,明确几丁质合成酶与该类抑制剂结合时起重要作用的氨基酸残基。结论本研究为基于几丁质合成酶三维结构的药物靶点设计提供重要的参考信息,同时也为抗真菌药的发展奠定坚实的理论基础。     

茄科雷尔氏菌脂酰-CoA合成酶的功能鉴定

【目的】茄科雷尔氏菌是一种常见的农作物致病菌,引起植物青枯病。研究其脂肪酸代谢途径将有助于寻找新的抗菌药物靶点,为防治青枯病害提供新的思路。【方法】利用大肠杆菌FadD序列,进行同源比对发现茄科雷尔氏菌GMI1000中RSc2857(RsFadD)具有较高的相似性,推测其具有脂酰-CoA合成酶活性。采用PCR扩增方法获得RsfadD基因,连入表达载体pBAD24M后互补大肠杆菌fadD突变株,并检测转化子的生长情况。RsfadD与pET-28b连接后,在大肠杆菌BL(DE3)中表达,并利用Ni-NTA纯化获得带有组氨酸标签的RsFadD,体外测定RsFadD的活性。利用同源重组方法,获得RsfadD敲除突变株,分析突变株的生长性状。【结果】RsfadD异体互补大肠杆菌fadD突变株,恢复突变株在以脂肪酸为碳源的基础培养基上生长。体外活性测定RsFadD具有脂酰-CoA合成酶活性,对不同链长的脂肪酸都具有活性,但活性低于大肠杆菌FadD。RsfadD突变株在添加不同链长脂肪酸的基础培养上仅能微弱生长,而在丰富培养基上生长无差异。【结论】茄科雷尔氏菌中RsfadD编码脂酰-CoA合成酶,在脂肪酸利用过程中发挥重要作用。但RsfadD突变株在基础培养基上微弱生长,说明茄科雷尔氏菌基因组中还有其他的脂酰-CoA合成酶基因。以上研究结果为进一步研究茄科雷尔氏菌中脂酰-CoA合成酶以及脂肪酸利用机制奠定了基础。     

阿氏浮丝藻mcyT基因序列多样性研究

为研究我国浮丝藻（Planktothrix Anagnostidis et Komrek）的毒素相关基因,选取分离自我国不同省份水体的13株阿氏浮丝藻,通过PCR检测其微囊藻毒素合成酶基因mcyA、mcyE及mcyT研究其毒素基因特性。PCR结果表明除mcyT之外其他引物检测均无扩增产物,说明这13株浮丝藻不具备产微囊藻毒素的能力。通过克隆测序得到mcyT序列,并进行分子系统分析,构建了关于mcyT序列的Neighbor-Joining系统树,结果表明mcyT序列可以将产毒与不产毒浮丝藻分为两大独立的分支,两个分支之间的最低序列相似度分别为98.5%和99.1%。研究结果可为后续研究我国浮丝藻的微囊藻毒素合成相关基因的多样性以及分子监测提供参考。       

硫腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆及其在盐胁迫条件下的不同表达

硫腺苷甲硫氨酸作为甲基供体在转甲基反应中起到重要作用.为了解硫腺苷甲硫氨酸在盐地碱蓬(Suaedasalsa (L.)Pall)耐盐中的作用,我们对可能编码硫腺苷甲硫氨酸合成酶的基因(SsSAMS2)进行了分析.该基因在经400 mmol/L NaCl处理的盐地碱蓬地上部分的λ-Zap cDNA文库中克隆到,其插入片段全长1 531 bp,包含一个395个氨基酸的开放阅读框架,该基因推断的分子量约为43 kD.SsSAMS2与长春花(Catharanthus roseus)的SAMS2在氨基酸水平上的一致性为93%.Southern杂交显示,SsSAMS2在盐地碱蓬基因组中可能是两个拷贝.Northern分析显示硫腺苷甲硫氨酸合成酶基因受NaCl等胁迫的正调控.酶活性检测表明,NaCl胁迫条件下该酶活性增强.     

以布氏锥虫亮氨酰tRNA合成酶为靶标的抗锥虫药物筛选系统的建立

锥虫是人的血液寄生虫,对热带乃至拉丁美洲贫困地区影响极大,但目前的传统治疗药物存在副作用大、有效性不断降低的问题。根据亮氨酰tRNA合成酶在微生物中可作为药物靶点的事实,在新型抗锥虫药物筛选中,通过对锥虫的亮氨酰tRNA合成酶的克隆、表达和纯化,以及该酶活性测定的优化,建立了该酶抑制物的筛选系统。筛选结果表明,这一以锥虫亮氨酰tRNA合成酶为靶标的抗锥虫药物筛选系统可以有效筛选抗锥虫化合物,选出的化合物有一定的抗锥虫特异性,并可以用于化合物的进一步优化和测定其半抑制浓度。使用这一系统筛选到了对锥虫有较好抑制作用,但对人类细胞毒性较小的一系列新型化合物,因而锥虫亮氨酰tRNA合成酶很可能成为开发有效抗锥虫药物的新靶标。     

Treatment of hepatitis C virus core-positive hepatocytes with the transfer of recombinant caspase-3 using the 2~,5~-oligoadenylate synthetase gene promoter

Hepatitis C virus （HCV） infection is a leading cause of liver-related morbidity and mortality throughout the world. There is no vaccine available and current therapy is only partially effective. Since HCV infects only a minority of hepatocytes, we hypothesized that induction of apoptosis might be a promising approach for the treatment of hepatitis C. In the present study, recombinant caspase-3 gene （re-caspase-3） was used because it has the ability to induce apoptosis that is independent of the initiator caspases. An HCV-specific promoter is required to regulate the cytotoxic caspase-3 expression in HCV-infected cells. It has been reported that HCV core protein can specifically activate the 21,5~-oligoadenylate synthetase （OAS） gene promoter in human hepatocytes. Therefore, we constructed an expression vector consisting of the re-caspase-3 under the OAS gene promoter （pGL3-OAS-re-caspase-3） and then investigated its effect on HCV core-positive liver cells. It was found that the pGL3-OAS-re-caspase-3 construct induced apoptosis in HCV core-positive liver ceils, but not in normal liver ceils. These results strongly suggested that the transfer of the re-caspase-3 gene under the OAS promoter was a novel targeting approach for the treatment of HCV infection.     

Characterization of the putative tryptophan synthase β-subunit from Mycobacterium tuberculosis

The increasing emergence of drug-resistant tuberculosis （TB） poses a serious threat to the control of this disease. It is in urgent need to develop new TB drugs. Tryptophan biosynthetic pathway plays an important role in the growth and replication of Mycobacterium tuberculosis （Mtb）. The β-subunit of tryptophan synthase （TrpB） catalyzes the last step of the tryptophan biosynthetic pathway, and it might be a potential target for TB drug design. In this study, we overexpressed, purified, and characterized the putative TrpB-encoding gene Rv1612 in Mtb H37Rv. Results showed that Mtb His-TrpB optimal enzymatic activity is at pH 7.8 with 0.15 M Na^＋ or 0.18 M Mg^2＋ at 37℃. Structure analysis indicated that Mtb TrpB exhibited a typical β/α barrel structure. The amino acid residues believed to interact with the enzyme cofactor pyridoxal-5＇-phosphate were predicted by homology modeling and structure alignment. The role of these residues in catalytic activity of the Mtb His-TrpB was confirmed by site-directed mutagenesis. These results provided reassuring structural information for drug design based on TrpB.     

红色亚栖热菌TPS/TPP海藻糖合成途径中相关基因的克隆、表达及功能鉴定

通过构建红色亚栖热菌(Meiothermus ruberCBS-01)的基因组DNA文库,克隆得到该嗜热菌海藻糖合成途径中的磷酸海藻糖合成酶(TPS)和磷酸海藻糖磷酸酯酶(TPP)基因。以pET21a为表达载体,将磷酸海藻糖合成酶和磷酸海藻糖磷酸酯酶在大肠杆菌中进行表达并纯化,利用薄层层析的方法验证了这两个酶的活性。同时,本研究检测了红色亚栖热菌在各种环境压力下细胞内含物成分的变化情况,发现在高渗环境压力的诱导下,该菌会在胞内积累大量的6-磷酸海藻糖,而并非海藻糖,这为进一步研究TPS/TPP和TreS途径在细胞体内的作用奠定了基础。     

枇杷果实发育过程中糖积累及相关酶活性变化研究

以'青种'、'霸红'和'鸡蛋白'3个枇杷品种为材料,测定不同果实发育时期果实中蔗糖、葡萄糖和果糖含量以及蔗糖代谢相关酶即酸性转化酶(AI)、中性转化酶(NI)、蔗糖合成酶(SS)和蔗糖磷酸合成酶(SPS)的活性,并对果实中糖积累与酶活性的关系进行了分析.结果表明:在果实膨大期(5月3日)之前,3种枇杷果实的蔗糖、葡萄糖和果糖积累缓慢,之后则迅速积累,存在着明显的转折点;果实成熟(5月23日)之后糖分积累速度趋于平稳.3种枇杷果实在发育过程中转化酶、蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶的活性变化与3种糖积累的动态变化趋势相一致.NI和AI活性在果实膨大期之前都较低且没有明显的变化,之后均快速上升;SS和SPS的活性在果实膨大期之前都很低且几乎无变化,随后'鸡蛋白'的活性迅速上升至果实成熟之后便缓慢上升,而'青种'和'霸红'随果实成熟度的增加而升高,但均低于'鸡蛋白'.可见,枇杷果实膨大期是糖分积累代谢活跃期,其糖积累受蔗糖代谢相关酶综合调控.     

红霉素对支气管上皮细胞谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）的影响

目的：探讨红霉素对支气管上皮细胞16-HBE谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）和谷胱甘肽（GSH）的影响。方法：应用红霉素5μg／ml分别孵育细胞16-HBE细胞2h,8h,16h,24h。分别应用显色法,Westemblot和荧光定量PCR方法检测细胞内GSH,γ-GCS重链蛋白和mRNA的表达。结果：经红霉素孵育后,16、24h后,细胞内GSH、γ-GCS重链蛋白和mRNA的表达较对照组增加。结论：红霉素对支气管上皮细胞谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）和GSH的合成有上调作用。