金属离子促进嗜热四膜虫错配修复蛋白Mlh3核酸内切酶活性

嗜热四膜虫有性生殖过程中生殖系小核延伸并活跃转录,减数分裂过程中染色体同源重组起始于程序化的DNA双链断裂的形成,DNA错配修复系统能够去除DNA复制过程中所引起的错配并促进同源重组。减数分裂特异表达的错配修复因子Mlh3对四膜虫的有性生殖是必需的,然而具体功能并不清楚。本研究人工合成MLH3（TTHERM_001044369）基因,构建重组表达质粒pGEX-MLH3, 转化大肠杆菌BL21（DE3）并获得重组表达的GST-Mlh3蛋白。纯化的GST-Mlh3蛋白在配位不同的金属离子Cu2+、Mn2+、Mg2+后,有效切割超螺旋质粒DNA。ATP和ADP可进一步促进Mlh3的核酸内切酶活性。突变Mlh3中离子结合模体DQHA(X)2E(E)4E中的D117和E123位点,Mlh3D117N/E123A的核酸内切酶活性降低。进一步删除离子结合和ATP结合位点的C端结构域,突变体的核酸内切酶活性进一步降低,表明Mlh3的核酸内切酶活性是离子依赖型。减数分裂期HA-Mlh3免疫共沉淀鉴定了Mlh3可能的相互作用因子链交换蛋白Dmc1、DSB修复蛋白Mnd1、MutS、染色体维持蛋白Smc2和Smc4。结果表明,四膜虫的Mlh3通过金属离子依赖的内切酶活性,以及与其他因子相互作用,在减数分裂错配修复和同源重组过程中发挥重要作用。     

八肋游仆虫一种富含三核苷酸重复序列的新基因GARP的克隆与序列分析

人类基因中三核苷酸重复序列拷贝数的异常扩增, 可导致多种神经系统疾病。一种富含GAA三核苷酸的GARP (glutamic acid-rich protein)基因从八肋游仆虫(Euplotes octocarinatus)大核文库中筛选获得。大核中该基因的染色体全长460 bp, 基因两端具有下毛类纤毛虫大核特有的端粒序列(C₄A₄C₄A₄C₄A₄C₄), 开放读框内含有一个TGA_(88-99)密码子, 在游仆虫中编码为半胱氨酸。经DNA Star 软件分析, 该基因编码的蛋白质由112个氨基酸组成, 预测其分子量为13 kDa, 等电点为3.82, 含有四个 [[alpha]] 螺旋和一个 [[beta]] 折叠。小核中对应的该基因含有两个内部删除序列, IES1 和IES2。IES1和IES2分别长41 bp, IES1以GA二核苷酸直接重复为删除信号, IES2以TA二核苷酸直接重复为删除信号。RT- PCR 证明该基因具有转录活性。     

驱动蛋白Kin11调控嗜热四膜虫生殖系小核的减数分裂

驱动蛋白(kinesin)是分子马达蛋白质超家族成员,主要参与囊泡与细胞器的运输、纺锤体组装、有丝分裂和减数分裂等过程。在减数分裂期,不同驱动蛋白发挥功能的调控机制并不十分清楚。嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)中含有14个驱动蛋白家族成员。其中,kinesin-6家族的唯一成员Kin11(TTHERM_00637750),在营养生长期低表达,饥饿期不表达,有性生殖期表达上调。Kin11编码1608个氨基酸,包含1个N端保守的马达蛋白结构域,C端卷曲螺旋(coiled-coil)结构域,并在N端和C端分别含有核定位信号NLS1和NLS2。Kin11在营养生长期和有性生殖期,定位在有丝分裂和减数分裂的小核和纺锤体上,并在有性生殖后期alignment阶段定位于小核上。Kin11与微管蛋白共定位于有丝分裂和减数分裂的纺锤体上。将Kin11的N端含有NLS1的1~400位氨基酸序列截短后,截断突变体定位在有性生殖减数分裂期的小核和纺锤体上。而将其C端含有NLS2的1008~1608位氨基酸残基截短后,截断突变体只能定位在有丝分裂和减数分裂后期的小核及有丝分裂的纺锤体上。敲除KIN11导致减数分裂过程中的纺锤体结构发生异常变化,小核染色体不均等分离与丢失,有性生殖发育停滞。结果表明,嗜热四膜虫驱动蛋白Kin11通过影响纺锤体结构,参与调控四膜虫生殖系小核在减数分裂过程中的正常分离。     

EoRab11a在游仆虫及HEK293T细胞中的定位

Rab11是一种在真核生物细胞生命活动过程中发挥多种调控作用的小分子GTP酶.EoRab11a是八肋游仆虫中的Rab11蛋白同源物,为了解EoRab11a蛋白在细胞中的功能,本研究将EoRab11a基因克隆到哺乳动物表达载体pEGFP-C2中,构建重组表达质粒pEGFP-C2-EoRab11a,转染HEK293T细胞并观察其细胞定位.在间期HEK293T细胞中,EoRab11a定位于细胞核附近;在游仆虫细胞中,EoRab11a具有相似的分布模式.在HEK293T细胞的胞质分裂过程中,EoRab11a在分裂沟附近、分裂沟收缩区、以及最后形成的中间体处分布,提示EoRab11a可能参与了胞质分离过程中分裂沟及中间体处的膜泡运输事件.     

肥厚性扁平苔藓皮损中浸润淋巴细胞的研究

目的探讨淋巴细胞浸润在肥厚性扁平苔藓发病机制中的意义。方法采用免疫组织化学SP法对10例肥厚性扁平苔藓患者皮损、20例非肥厚性扁平苔藓患者皮损及10例正常人皮肤中CD3、CD4、CD8、CD20进行检测。结果所有患者皮损均以CD3^＋’T、CD4^＋T、CD8^＋T细胞浸润为主,散在CD20^＋B细胞浸润。肥厚性皮损中浸润T淋巴细胞数少于非肥厚性皮损（P〈0．01）,CD20^＋B细胞占浸润淋巴细胞百分率高于非肥厚性皮损（P〈0．05）。正常人皮肤仅在真皮偶见CD3^＋T细胞。结论肥厚性扁平苔藓皮损T淋巴细胞的减少,B淋巴细胞的增多表达可能与疾病的持续存在及局部过度增殖性改变密切相关。     

大气CO2浓度升高对稻田根际土壤甲烷氧化细菌丰度的影响

甲烷氧化细菌是目前已知的稻田甲烷氧化唯一生物,在减少稻田甲烷排放、降低大气甲烷浓度方面发挥着重要作用.利用中国稻/麦轮作FACE(Free Air Carbon-dioxide Enrichment)试验平台,采用实时荧光定量PCR技术,研究了大气CO2浓度升高下,典型水稻生长期根际土壤甲烷氧化细菌数量的变化规律,及其对不同施肥处理(高氮HN和常氮LN)的响应.2009和2010连续2a的观测结果表明,大气CO2浓度升高促进了2009年秧苗期和分蘖期,2010年秧苗期、拔节期和灌浆期甲烷氧化细菌的生长;并可能对2010年常氮条件下成熟期甲烷氧化细菌产生了较显著(P＜0.1)抑制;进一步针对甲烷氧化细菌主要类群的分析表明,高氮条件下大气CO2浓度升高提高了稻田根际土壤中Ⅰ型甲烷氧化细菌的丰度.     

不同核桃品种的耐寒性及其渗透调节机制

以‘香玲’、‘鲁W06-1’、‘西洛3号’3个核桃品种（优系）为材料,对低温胁迫各材料的耐受情况及相应渗透调节物质含量和总蛋白质表达的变化情况进行分析,以揭示低温胁迫下不同核桃品种（优系）的渗透调节机制和蛋白质组分差异。结果显示:（1）3个核桃品种（优系）休眠枝条解剖结构分析表明,‘鲁W06-1’一年生休眠枝条的木质部比率最大,‘西洛3号’的韧皮部厚度显著大于其他两个品种（优系）。（2）随胁迫温度降低和胁迫时间的延长,枝条相对电导率（REC）逐渐升高,且‘西洛3号’的相对电导率均大于‘鲁W06-1’和‘香玲’。（3）核桃枝条可溶性糖、可溶性蛋白和游离脯氨酸含量均随温度降低先增加后减小,但各品种(优系)增至最大值的温度不同,其中‘鲁W06-1’枝条积累可溶性蛋白的速度和幅度较大,且各低温胁迫处理后的枝条可溶性糖和游离脯氨酸的含量也更高;3种渗透调节物质含量之间均呈极显著正相关关系,可溶性糖与游离脯氨酸含量的相关系数达0.844,表明二者对低温胁迫的应答反应密切相关。（4）在不同胁迫温度和胁迫时间处理后,核桃枝条的蛋白质表达谱带总体相似,但检测出6条表达量明显增加的差异条带,它们的分子量范围为38.9～87.9 kD。研究表明,3个核桃品种（优系）的耐寒性强弱为‘鲁W06-1’>‘香玲’>‘西洛3号’;低温胁迫下,核桃枝条迅速积累可溶性蛋白,然后积累可溶性糖和游离脯氨酸,并以耐寒性较强品种（优系）积累速度更快、积累量更大,且耐寒性较强的品种（优系）枝条蛋白谱带出现较多表达量增加的条带。     

赤霉素对入侵植物凤眼莲营养生长和克隆繁殖的调控

【目的】明确植物激素赤霉素对入侵植物凤眼莲营养生长和无性克隆繁殖的影响,探索凤眼莲快速生长繁殖的内在调控机理,为其科学防控及合理利用提供参考。【方法】在温室条件下用改良霍格兰营养液培养凤眼莲幼苗,并定期对其叶茎表面喷洒50μmol·L~(-1)赤霉酸(GA_3),培养4周后检测其营养生长和无性繁殖指标,包括株高、根长、膨大茎周长、叶片的数量、叶片的长和宽、叶片叶绿素含量和氮含量、茎上组织重量、根重,以及克隆株数量和匍匐茎长度。【结果】相比于喷洒无菌水的对照,50μmol·L~(-1)GA_3处理后的凤眼莲叶柄明显增长,株高更高,根系较短,膨大茎消失;叶片数量无显著差别,但叶片形状由肾圆形变为心形,叶片宽度变窄,长度基本无变化,总体叶面积变小;叶片所含叶绿素和氮含量更少,茎上组织和根系重量变轻,但根冠比无明显变化,且基本不产生克隆株。【结论】外源喷洒赤霉素可以改变凤眼莲的植株形态,并抑制凤眼莲的叶片发育,从而造成其生物量累积和克隆繁殖水平的降低。     

嗜热四膜虫胱硫醚γ-裂解酶Cgl1的表达、定位及功能分析

含硫氨基酸在不同的生物体中具有重要调节功能,转硫途径相关酶促进半胱氨酸的生成和硫化氢产生。本研究从嗜热四膜虫中鉴定一种胱硫醚γ-裂解酶（cystathionine γ-lyase 1,CGL1,TTHERM_00052400）基因。CGL1在营养生长期高水平表达,而在饥饿阶段和有性生殖期,维持在较低的表达水平。通过密码子优化,人工合成CGL1基因,构建重组表达质粒pGEX-CGL1,转化大肠杆菌BL21(DE3)。E.coli/pGEX-CGL1表达重组蛋白质GST-Cgl1,并通过亲和层析获得纯化。GST-Cgl1裂解胱硫醚产生半胱氨酸,也具有裂解半胱氨酸和同型半胱氨酸产生H2S的活性。进一步构建重组质粒pNEO4-3HA-CGL1和pSMC1hpNEO-CGL1,转化四膜虫细胞,获得带有HA标签和干扰CGL1的突变体细胞株。免疫荧光定位表明,HA-Cgl1生长期定位在亲本大核,饥饿期定位在细胞质,有性生殖前期定位在亲本大核,而在后期定位在胞质中。CGL1干扰的突变体细胞株在有性生殖过程中不能形成合子核,发育中的小核异常降解,产生仅有大核的异常单细胞。结果表明,嗜热四膜虫含有进化中保守的胱硫醚γ-裂解酶Cgl1。Cgl1具有产生和裂解半胱氨酸的活性。Cgl1定位在细胞质和细胞核中,参与了有性生殖过程细胞核的发育。     

dl-3-正丁基苯酞对脑损伤大鼠的神经保护作用的实验研究

目的:研究dl-3-正丁基苯酞(NBP)对脑损伤大鼠的神经保护作用。方法:将100只7周龄清洁级雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分成5组,分别为假手术组、模型组、NBP低、中和高剂量组,每组20只。使用控制性皮层撞击损伤建立中型大鼠颅脑损伤模型。将NBP溶解在大豆油中,NBP低、中和高剂量组分别按照每天20、40和80 mg/kg的剂量灌胃,假手术组和模型组灌胃等体积的大豆油,共给药2周。采用改良神经功能缺损评分(m NSS)对大鼠的神经系统状况进行评价。检测各组大鼠治疗后的脑组织含水量以及脑组织中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平。TUNEL方法鉴定细胞的凋亡。通过RT-PCR、Western blot或免疫组化检测脑组织中Nrf2、NQO-1、HO-1、ApoJ、MMP9、AQP4、Caspase-3和AKT的表达。结果:NBP治疗2周后,NBP低、中和高剂量组大鼠的m NSS评分和神经元凋亡率以剂量依赖性方式显著降低(P0.05)。与模型组比较,NBP低、中和高剂量组大鼠的脑含水量均显著降低(P0.05)。与模型组比较,NBP低、中和高剂量组大鼠的MDA显著降低,而SOD和GSH-Px显著升高(P0.05)。与模型组比较,NBP低、中和高剂量组大鼠的细胞核Nrf2显著升高,而细胞质Nrf2显著降低(P0.05)。与模型组比较,NBP低、中和高剂量组大鼠的NQO-1和HO-1蛋白表达水平显著升高(P0.05)。与模型组比较,NBP低、中和高剂量组大鼠的AQP4、MMP-9、ApoJ和Caspase-3的m RNA和蛋白表达水平均显著降低,而AKT显著升高(P0.05)。结论:NBP对创伤性颅脑外伤大鼠具有一定的神经保护作用。