人突触小体相关蛋白25单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的:制备抗人突触小体相关蛋白25(SNAP25)的鼠源单克隆抗体。方法:利用大肠杆菌表达SNAP25蛋白,纯化后免疫BALB/c小鼠制备杂交瘤细胞,筛选针对SNAP25的阳性杂交瘤细胞株,鉴定抗体亚型;用杂交瘤细胞株制备腹水单抗,纯化后利用SDS-PAGE检测抗体纯度。结果:表达并纯化得到纯度大于90%的SNAP25蛋白,免疫小鼠后经2轮筛选得到12株阳性杂交瘤细胞株,其中抗体重链包括IgG1、IgG2型,轻链大部分为κ链;选择具有相对较高抗原结合活性的14号杂交瘤细胞株制备腹水,纯化后得到纯度大于90%的抗体。结论:获得1株高纯度的针对SNAP25的鼠源单克隆抗体,为肉毒毒素的检测奠定了基础。     

信号肽对酮古龙酸菌山梨糖脱氢酶表达的影响

目的:在大肠杆菌中表达山梨糖脱氢酶(SDH),通过比较携带及不携带自身信号肽时SDH功能的差异,研究信号肽的作用。方法:通过PCR从酮古龙酸菌SCB329基因组中扩增带有自身信号序列和不带自身信号序列的sdh基因序列,连接至载体pET22b,在大肠杆菌中表达;利用载体的周质信号肽将缺少自身信号肽的SDH在大肠杆菌周质中表达,考察并比较这些表达情况的异同。结果:各种方式下表达的SDH都有活性,并能在体外体系中实现产酸;同时,在酶的前端带上自身信号肽或载体信号肽的情况下,在添加人工电子受体后能够实现活菌体内产酸。结论:山梨糖脱氢酶前端有一段与蛋白的周质定位相关的信号肽,去除该信号肽后酶的表达量有所增强,但在一定情况下影响了SDH的体内产酸作用。     

酮古龙酸菌细胞色素c基因的克隆及表达

目的:从酮古龙酸菌SCB329中分离细胞色素c(Cytc)相关基因,在大肠杆菌中进行表达并验证。方法:根据酮古龙酸菌SCB329基因组序列设计引物,通过PCR从SCB329基因组中扩增cytc基因,酶切后连接pET22b表达载体,转化至大肠杆菌DH5α后提取质粒,经PCR、质粒双酶切及测序鉴定后,转入大肠杆菌BL21(DE3),并对表达条件进行考察;用Chelating Sepharose珠粒对可溶性的Cytc-His融合蛋白进行纯化;经光谱扫描和血红素染色等方法对表达蛋白定性分析。结果:PCR扩增的cytc基因长513 bp;重组菌在IPTG浓度为0.025 mmol/L的条件下,于28℃诱导10 h后,SDS-PAGE分析可见表达条带,相对分子质量约为18×103;Ni柱亲和层析纯化得到目的蛋白,纯化蛋白经光谱扫描呈现Cytc特征峰,血红素染色呈现阳性结果。结论:从酮古龙酸菌SCB329中分离得到一种cytc基因,并表达纯化了融合蛋白Cytc-His,纯化蛋白呈现Cytc特性,为研究酮古龙酸菌中产酸关键酶的电子传递机制奠定了基础。     

山梨糖脱氢酶在乙酸钙不动杆菌中的表达

目的:在乙酸钙不动杆菌Y2004中表达山梨糖脱氢酶。方法:将酮古龙酸菌山梨糖脱氢酶基因sdh以及从pWH1266质粒上扩增的复制原点ori先后酶切连接到pBBR1MCS2质粒上,构建pBBR1MCS2-ori-sdh穿梭质粒;再以pBBR1MCS2-ori-sdh/DH5α为供体菌、乙酸钙不动杆菌Y2004为受体菌、pRK2013/HB101为辅助菌进行三亲本接合转移;从氨苄青霉素和卡那霉素双抗平板上挑取转化子进行培养,通过菌落PCR和提取质粒复转筛选阳性克隆,再通过活性电泳和体外糖酸转化实验检测阳性克隆的山梨糖脱氢酶活性。结果:构建了pBBRMCS2-ori-sdh质粒并转入乙酸钙不动杆菌Y2004中,活性电泳和体外实验证实阳性克隆具有山梨糖脱氢酶活性。结论:实现了山梨糖脱氢酶在乙酸钙不动杆菌Y2004中的表达,为单菌糖酸转化的进一步研究奠定了基础。     

酮古龙酸菌山梨酮脱氢酶的原核表达及活性鉴定

目的:克隆酮古龙酸菌Y25的山梨酮脱氢酶基因sndh2,在大肠杆菌中进行表达,并检测表达产物的活性。方法:以酮古龙酸菌Y25基因组DNA为模板,PCR扩增sndh2基因,连接到pET22b表达载体后转入大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达;对菌体裂解液进行SDS-PAGE分析;以D-木糖为底物,采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后活性染色及DCIP检测法鉴定表达产物的脱氢酶活性。结果:扩增得到1290 bp的山梨酮脱氢酶基因;构建了表达质粒pET22b-sndh2,SDS-PAGE结果显示获得相对分子质量为43.1×103的可溶性表达产物;非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳胶上出现的蓝黑色条带及DCIP检测液颜色的变化说明表达产物在以D-木糖为底物时表现出脱氢酶活性。结论:在大肠杆菌中表达的山梨酮脱氢酶具有生物活性。     

节杆菌乙内酰脲水解酶与GST蛋白融合表达及纯化

目的：构建节杆菌BT801乙内酰脲水解酶（HyuH）与GST融合表达载体,利用大肠杆菌表达GST-HyuH融合蛋白并纯化。方法：将节杆菌HyuH基因插入载体pGEX-KG构建重组表达质粒pGEX-KG-HyuH;SDS-PAGE检查GST-HyuH的表达;利用薄层层析检查融合蛋白的HyuH活性;最后利用谷胱甘肽-Sepharose 4B树脂纯化融合蛋白GST-HyuH。结果：SDS-PAGE表明重组菌在相对分子质量77×103处有特异的蛋白表达条带,且重组菌可以水解5-苯基乙内酰脲,纯化得到了有HyuH活性的纯度较高的GST-HyuH融合蛋白。结论：得到了有HyuH活性的GST-HyuH,为进一步研究HyuH的修饰奠定了基础。     

A型肉毒毒素单克隆抗体的制备和鉴定

目的:制备并鉴定抗A型肉毒毒素重链C端(BoNT/AHc)鼠源单抗。方法:以BoNT/AHc蛋白为抗原免疫小鼠,利用杂交瘤技术获得鼠源单抗,通过抗体分型、SDS-PAGE、Western印迹及ELISA法分析鉴定。结果:筛选得到3株鼠单抗1B1、1B2、1C6,重链类型均为IgG1,轻链类型均为κ型;3株纯化抗体的纯度达90%以上,均能与抗原BoNT/AHc特异性结合,亲和力常数分别为1.43×10~8、2.31×10~8、1.44×10~9L/mol;叠加ELISA结果显示3株抗体与抗原BoNT/AHc结合位点相同或相近。结论:筛选得到3株能与BoNT/AHc特异性结合的鼠源单抗,为A型肉毒毒素中和抗体的研发,以及快速有效的肉毒毒素检测方法的建立奠定了基础。     

酮古龙酸菌山梨醇脱氢酶的原核表达及活性检测

目的：克隆酮古龙酸菌Y25的山梨醇脱氢酶基因sldh,在大肠杆菌中进行表达并检测表达产物的活性。方法：以酮古龙酸菌Y25基因组DNA为模板,PCR扩增sldh基因,连接到表达载体pTIG,转入大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达;取表达菌体、菌体裂解上清和沉淀进行SDS-PAGE分析;以山梨醇为底物,通过活性电泳、体外转化及休止细胞转化进行sldh基因表达产物的活性检测。结果：扩增得到1740 bp的山梨醇脱氢酶基因,构建了表达质粒pTIG-sldh并在大肠杆菌中获得表达,SDS-PAGE结果显示表达产物为可溶性形式,相对分子质量约58×10^3;活性电泳结果说明表达产物在以山梨醇为底物时表现出脱氢酶活性,而经体外转化和休止细胞转化后薄层层析检测出转化产物山梨糖的存在。结论：在大肠杆菌中实现了酮古龙酸菌山梨醇脱氢酶的可溶性表达,且表达的重组脱氢酶能将山梨醇脱氢生成山梨糖。     

通过转座诱变筛选甲基营养菌吡咯喹啉醌合成缺陷突变株

目的:对电转化等Tn5转座诱变条件进行优化,获得大量甲基营养菌MP688突变株,筛选吡咯喹啉醌(PQQ)合成缺陷突变株,并对失活基因进行鉴定。方法:通过电击方法对MP688株进行Tn5转座诱变;通过检测PQQ产量,选择不产或几乎不产PQQ的突变株,用质粒拯救的方法鉴定突变基因。结果和结论:确定了MP688株电击转化的最优条件,优化了质粒拯救法鉴定突变基因的实验方案,得到了1株PQQ合成明显降低的突变株RM16,并确定了转座子在染色体上的插入位点。     

酮古龙酸菌细胞色素c氧化酶亚基Ⅱ的融合表达及纯化

目的:利用大肠杆菌融合表达酮古龙酸菌细胞色素c氧化酶亚基Ⅱ(CcoⅡ)与谷胱甘肽S-转移酶(GST)并纯化。方法:根据酮古龙酸菌Y25基因组序列设计引物,通过PCR扩增CcoⅡ基因,酶切后连接pGEX-KG表达载体,转化至大肠杆菌获得重组菌,经IPTG诱导表达融合蛋白GST-CcoⅡ,用谷胱甘肽-Sepharose 4B树脂亲和纯化融合蛋白,并利用Western印迹及质谱对表达蛋白进行鉴定。结果:扩增得到867 bp的CcoⅡ基因,构建了pGEX-KG-CcoⅡ融合表达载体,重组菌经0.4 mmol/L IPTG于20℃诱导16 h,SDS-PAGE分析显示有可溶性表达条带,相对分子质量约为59×103;Western印迹及质谱分析表明,利用亲和层析方法纯化到了目的蛋白。结论:表达并纯化了GST-CcoⅡ融合蛋白,为酮古龙酸菌电子传递链的研究奠定了基础。