Barnase在大肠杆菌中的分泌表达和诱导条件优化

从解淀粉芽孢杆菌中PCR分别扩增解淀粉芽孢杆菌核糖核酸酶barnase基因及其抑制剂barstar基因,采用将barnase基因置于barstar基因保护下的克隆策略,以pET-22b（＋）质粒为基础,构建大肠杆菌分泌型表达质粒．IPTG诱导表达目的蛋白后将培养基蛋白进行SDS-PAGE分析并从诱导温度、IPTG诱导浓度和诱导时间三方面初步优化诱导表达条件．     

山东省某地区奶牛源大肠埃希菌的血清型、耐药特性及分子特性

【目的】旨在对从山东省某地区4个健康奶牛养殖场分离到的大肠埃希菌进行优势血清型、耐药特性、Ⅰ类整合子基因盒携带情况以及系统进化群分析。【方法】采集194份来自山东省某地区4个规模化奶牛场奶牛新鲜粪便样品,进行大肠埃希菌分离和鉴定,利用常用大肠埃希菌诊断血清进行血清型鉴定;利用10%的绵羊血平板检测溶血性;利用K-B法检测对14种常规抗菌药物的敏感性;利用聚合酶链式反应(PCR)检测革兰阴性菌常见的6大类24种耐药基因、Ⅰ类整合子基因盒结构并对目的条带测序分析;利用细菌多位点序列分型(Multilocus sequence typing,MLST)技术分析大肠埃希菌的ST型并使用eBURST v3软件分析菌株之间的克隆关系。【结果】从194份新鲜粪便样品中分离到171株大肠埃希菌,其中主要为致病性(19.9%)和侵袭性大肠埃希菌(17.0%),优势血清型分别为O128:K67(12/171)和O143:K7(12/171)。另外,具有溶血性的大肠埃希菌阳性率为9.4%(16/171);药敏试验结果显示多重耐药菌株的比率为22.2%,其中对氨苄西林耐药率最高为33.9%,四环素次之,为24.0%;PCR检测耐药基因和整合子结果显示,59.1%的菌株携带β-内酰胺类耐药基因blaTEM,59.1%的菌株携带氨基糖苷类耐药基因ant(2′),未检测到四环素耐药基因tetA和tetB;Ⅰ类整合子的阳性率为4.1%(7/171),dfrA12-aadA2-sul1为优势基因盒结构(4/171);MLST将大肠埃希菌分为8种ST型,其中,ST155(10/171)和ST58(45/171)形成一个克隆复合物且没有发现新的ST型。【结论】本研究证实,从该地区规模化健康奶牛场新鲜粪便中分离到的大肠埃希菌优势血清型为O128:K67和O143:K7;少部分大肠埃希菌具有溶血性;仅对氨苄西林、四环素等具有较高的耐药率;优势基因盒结构为dfrA12-aadA2-sul1;MLST分型显示不同奶牛场分离出亲缘关系较近的菌株,其分布具有多态性,血清型与ST型之间无相关性。本研究表明源自表观健康的奶牛的大肠埃希菌存在多重耐药现象,具有食品公共卫生安全隐患,该研究对于提升规模化奶牛场奶制品的安全生产与质量评估具有一定的理论指导意义。     

丁酸梭菌影响肠炎沙门氏菌对SPF小鼠致病性的作用

【目的】旨在探究丁酸梭菌影响肠炎沙门氏菌(CVCC3377)对SPF小鼠的致病性及对小鼠的保护作用。【方法】选用72只6周龄SPF级雌性C57BL/6小鼠,按照完全随机区组设计分为阴性对照(CON)、饲喂丁酸梭菌组(CB)、沙门氏菌感染组(SE)和丁酸梭菌保护组(CB+SE)4组,每组18只。CON组和SE组饲喂基础日粮和饮水,CB组和CB+SE组饲喂基础日粮和每天更换添加丁酸梭菌(1×10~7CFU/mL)的饮水,连续饲喂一周;第8天进行肠炎沙门氏菌感染实验,分别对SE组和CB+SE组灌服0.2mL 1.1×10~4CFU/只的肠炎沙门氏菌,同时对阴性对照组和丁酸梭菌组灌服0.2mL生理盐水。在感染后第6天处死小鼠并采集肝脏、脾脏和盲肠及内容物样品。采用H.E染色检测肝脏和脾脏组织的病理学变化,免疫组化检测脾脏组织中TLR4、MyD88蛋白的表达水平,荧光定量PCR检测盲肠组织中TNF-α和IL-6的表达水平,并通过高通量测序方法分析其对肠道菌群的影响。【结果】结果显示,丁酸梭菌能够缓解肠炎沙门氏菌感染引起的小鼠体重下降;H.E染色结果显示,丁酸梭菌可以缓解肠炎沙门氏菌感染造成的组织损伤;免疫组化结果显示,丁酸梭菌可降低脾脏组织细胞中TLR4、MyD88蛋白的表达水平,荧光定量PCR结果显示肠炎沙门氏菌能够显著升高盲肠组织中TNF-α(P0.05)和IL-6的表达水平,在此基础上饲喂丁酸梭菌能够降低TNF-α和IL-6的表达水平。高通量测序结果显示,丁酸梭菌组Chao1指数、ACE指数和Shannon指数均高于对照组和沙门氏菌感染组(P0.05),丁酸梭菌可显著降低放线菌门(Actinobacteria)和疣微菌门(Verrucomicrobia)在肠道微生物中的比例(P0.05),另外,丁酸梭菌可以增加乳酸菌属在肠道微生物群落的相对丰度(P0.05)。【结论】结果表明,丁酸梭菌可以提高小鼠免疫力,缓解由于沙门氏菌感染引起的炎症反应,增加肠道微生物多样性,调节肠道菌群结构。     

中国人COL2A1基因座的扩增片段长度多态性

用聚合酶链式反应、高分辨聚丙烯酰胺凝胶水平电泳及银染技术对位于人类Ⅱ型胶原基因终止密码下游非转录区１．３ｋｂ处的可主数目串联重复育列进行了研究。制备了由人类不同基因型ＤＮＡ混合而成的人类等位基因型参考物，根据实验结果进行了命名。