抗病毒基因与哺乳动物抗感染育种研究进展

近年来,人们利用基因工程的原理和技术分离或合成了诸如干扰素、白介素等一类细胞因子的DNA或cDNA,这类物质在抗病毒感染及免疫调节等方面都具有重要的功能;同时,人们还发现了诸如反意RNA、Ribozyme等一类小分子RNA,它们在病毒的转录及复制过程中起着重要的调控作用。将这些DNA、cDNA或RNA导入体外培养细胞,转化细胞可以获得抗病毒功能。以显微注射为主要手段的转基因动物构建技术,可以有效地将这些外源目的基因导入动物受精卵,使其整合、表达,并于某些转基因动物体内产生相应的抗感染等生物学效应,从而使动物抗感染基因工程育种的设想成为可能。     

猪瘟病毒石门株特异cDNA片段的扩增与序列分析

以猪瘟病毒感染细胞中提取的细胞总ＲＮＡ为模板,应用反转录─聚合酶链反应,在化学合成的两对特异引物引导下,成功地扩增出了两个石门株的ｃＤＮＡ片段。电泳证明它们的大小与预计的３４６ｂｐ和１２０ｂｐ完全一致。酶切分析证实了它们应有的酶切位点。随后对这两个片段进行了克隆和序列测定,并与国外株的序列进行了比较。结果证明本实验扩增的两个ｃＤＮＡ序列与Ａｌｆｏｒｔ株和Ｂｒｅｓｉａ株的同源性分别是９５．２％和９８．５％。     

应用细菌内同源重组机制快速克隆腺病毒基因组的研究

以犬2型腺病毒为载体进行疫苗和基因治疗的研究,是近年的研究热点.目前的焦点问题是新型载体的构建,经典的方法是体外连接,费时、费力.     

犬2型腺病毒E1转化细胞的建立

为建立能表达犬2型腺病毒(CAV2)E1基因的辅助细胞,本研究用含CAV2E1基因的重组质粒pcE1t对DK细胞进行转染,经G418的筛选,得到26个细胞克隆。用CAV2E1A特异引物对各细胞克隆进行PCR和RTPCR检测,PCR结果表明转染后的细胞克隆都能扩增出536bp的特异性片段,但仅有6株为RTPCR强阳性,能扩增出652bp的特异带。再对RTPCR强阳性的细胞克隆进行Westernblot分析,最终挑选到一个既能转录E1A基因,又能表达E1B19kD蛋白的克隆细胞株(DKE1)。     

猪瘟DNA疫苗制备工艺研究

猪瘟DNA疫苗制备工艺的建立是其走向产业化 ,从而在猪瘟防制中发挥作用所需解决的关键问题之一。以猪瘟DNA疫苗质粒pVAXE2IL2转化大肠杆菌后 ,转入发酵罐发酵培养。将菌体悬浮裂解和中和后 ,经澄清和浓缩处理 ,上阴离子交换色谱和体积排阻色谱进行纯化 ,首次提纯出符合药学规格的猪瘟DNA疫苗 ,且整个工艺回收率达 64.53% ,从而表明所建立的工艺为猪瘟DNA疫苗规模化生产奠定了技术基础。     

体内精原干细胞转染法建立转基因小鼠

将人Bcl-2 cDNA与小鼠乳清酸蛋白(WAP)5’上游调控序列融合后,与脂质体按一定比例混合,再加入适量的台盼蓝制成转染液,注入到小鼠睾丸中的曲细精管中,转染精原干细胞以探讨建立转基因小鼠的可行性。共注射了3只公鼠,4天后将公鼠与发情母鼠合笼交配。共生仔鼠20只。检测结果表明,有3只呈PCR阳性,Southern blot检测,阳性鼠2只,1只公鼠,1只母鼠,其中,公鼠意外死亡;Western blot证实,1只母鼠的乳腺组织表达了Bcl-2蛋白,其F1代的16只小鼠中。有7只呈PCR阳性。证实了体内精原干细胞转染建立转基因动物的可行性。     

狂犬病毒糖蛋白cDNA在BHK细胞中的整合及表达

狂犬病毒是引起动物及人狂犬病的病原。病毒颗粒由脂质囊膜、核糖核蛋白核心和纤状突起(糖蛋白又叫G蛋白)组成。G蛋白为病毒粒子的重要成分之一,具有血凝活性,并提供毒粒吸附宿主细胞受体的位点,其成熟形式含有505个氨基酸。依毒株不同,该蛋白上有2或3个潜在糖基化位点。糖蛋白既是病毒特异性辅     

表达Irkut病毒糖蛋白的重组复制缺陷型人5型腺病毒的构建与小鼠免疫试验

本研究利用复制缺陷型人5型腺病毒载体,表达了我国蝙蝠狂犬病毒分离株IRKV-THChina12的G基因,并将重组病毒命名为rAd5-IRKV-G。Western blot和间接免疫荧光试验证明,IRKV-THChina12的G基因在重组腺病毒感染的293AD细胞中得到表达。将rAd5-IRKV-G对小鼠分别进行腹腔和肌肉免疫,同时设立wt-rAd5对照,结果显示两种免疫方式均能诱导小鼠产生抗IRKV中和抗体,且rAd5-IRKV-G组与wt-rAd5组差异显著(P≤0.05),腹腔免疫组与肌肉免疫组无显著差异(P0.05)。结果表明,Irkut病毒糖蛋白可以作为疫苗抗原,而且构建的重组腺病毒具有较好的免疫原性。     

精原干细胞体内转染途径建立转基因小鼠的可行性研究

目前,生产转基因动物的难度很大,成功率很低,这是因为制备转基因动物的主要方法是向受精卵原核中注射DNA。这种方法有其弱点,首先作为外源基因受体细胞的受精卵数量有限;其次外源基因的整合和表达的筛选工作不能在细胞水平上进行,只能在子代动物出生后,即在个体水平上进行选择,这就增加了工作量,而且周期长,成功率低,成本大,在大动物上实施起来尤其困难。这就要求我们找到一种更为有效而又简捷的转基因动物的制备方法。利     

应用细菌内同源重组机制快速克隆腺病毒基因组的研究

A novel procedure was used for cloning large adenovirus genome fragment by the homologous recombination in E.coli strain BJ5183. The 11.2Kb downstream fragment of the CAV-2 strain YCA18 genome was cloned by homologous recombination, the 1029bp left end and the 970bp fight end of this fragment were separately amplified by PCR. They were then cloned into plasmid pPoly2 with direction from left fragment to fight fragment, obtaining a “rescue” plasmid pT615. The pT615 was liberalized by Hind Ⅲ and PstⅠ digestion and was cotransformed with the purified CAV-2 genome which was cut by BstBI into competent E.coli strain BJ5183. Recombinant plasmids harboring the 11.2Kb downstream fragment of CAV-2 genome were obtained after bacterial intermolecular homologous recombination. The recombinant efficiency of all E.coli strains tested was 78.3%. One of the recombinant plasmids, pT618, was further identified by enzyme digestion analysis and PCR amplification. The results showed the plasmids contained the 11.2kb fragment downstream the genome of CAV-2.