糖蛋白G 基因在基因组P-M 位的插入重组表达对狂犬病毒Flury LEP 致病力的影响

【目的】研究狂犬病病毒Flury鸡胚低代毒株(Flury LEP)在基因组P-M位增加糖蛋白基因(G基因)的重组表达对病毒致病力的影响。【方法】利用反向遗传操作技术,构建了P、M基因之间额外插入G基因的重组狂犬病病毒Flury LEP株(rLEP-PGM),并对重组病毒的生物学特性及对小鼠的致病性进行了初步研究。【结果】亲本株和重组病毒具有相似的生长特性,LEP和rLEP-PGM在BHK-21细胞的生长滴度分别为4×106 FFU/mL和2.5×106 FFU/mL,在小鼠神经母细胞(NA)的生长滴度分别为4×107 FFU/mL和2.5×107 FFU/mL;嗜神经指数均为1;Western blot显示,rLEP-PGM在感染细胞的G蛋白表达量比LEP显著提高;小鼠感染试验显示,rLEP-PGM与LEP脑内注射小鼠的LD50分别为3 FFU和1 FFU,肌肉注射途径的LD50分别为4×104 FFU和3.2×105 FFU。【结论】P、M基因之间插入一个额外的G基因能够提高G蛋白的表达水平,同时增强重组病毒外周侵入中枢神经系统的能力。     

八种桑黄粗多糖化学组成与体外免疫活性的比较

采用水提醇沉法提取了八种不同桑黄子实体的粗多糖,对八种桑黄粗多糖进行了多糖和蛋白质含量的测定,并进行了单糖组成和氨基酸成分的分析,同时对八种桑黄粗多糖进行了体外淋巴细胞增殖实验。结果表明,八种桑黄粗多糖提取物中多糖和蛋白质的含量有较大差异,单糖组成、氨基酸种类及含量上也有一定的差异。体外对小鼠脾淋巴细胞增殖作用的测定结果显示,八种桑黄粗多糖均表现了一定的活性,其中PB-10和JSH在样品浓度50μg/mL时就有较好的活性,同时PB-10P和JSHP的多糖和蛋白质含量也较其它品种高。研究结果在一定程度上说明桑黄粗多糖的免疫活性与多糖和蛋白质的含量和组成有着密切的关系。     

酿酒酵母发酵降解灵芝胞外多糖组分分析及活性研究

本研究采用酿酒酵母发酵的方法对灵芝胞外多糖进行了降解,并对其产物在表观粘度、分子量、多糖得率和含量及单糖组成和生物活性等方面进行了系统比较和分析。结果表明,灵芝发酵胞外液经酿酒酵母培养后,所得胞外液的表观粘度明显降低,其中多糖的分子量也随酵母培养时间的延长出现下降趋势,大分子多糖的分子量从3.55×10 ⁶g/mol下降到1.93×10 ⁶g/mol,低分子多糖的分子量从6.18×10 ⁴g/mol下降到3.11×10 ⁴g/mol。多糖得率和含量测定结果显示,经酵母培养后,灵芝胞外液中20%乙醇沉淀所得20E组分得率明显降低,从2.43g/L下降到0.98g/L,但该组分多糖含量均较高,达到70%以上;而70%乙醇沉淀所得70E组分得率明显增加,达到1.87g/L。单糖组成分析表明,20E组分主要由葡萄糖组成,70E组分主要由甘露糖组成。各组分均表现出较好的与Dectin-1受体结合激活NF-κB增强免疫的活性,且经酿酒酵母发酵24h所得70E组分的活性最好。     

蛹虫草子实体中甘露醇含量的测定

建立了HPLC法测定蛹虫草子实体中甘露醇含量的方法。通过比较提取溶剂、提取方式及提取时间等条件对甘露醇提取效果的影响,确定甘露醇分析的前处理方法为:1g子实体粉中加入150 mL 90%乙醇热回流提取1h。采用SUGAR SP0810柱(300 mm×8 mm)为分析柱,超纯水为流动相,流速1.0 mL/min,柱温70℃,示差折光检测器检测,进样量10μL。甘露醇在0.04-9.9 mg/mL范围内线性关系良好,回归方程为y=103860x+2183.9(r=0.9999),平均回收率为104.27%,RSD=2.19%(n=9)。本方法准确度高,稳定性、精密度、重现性好,适用于蛹虫草子实体中甘露醇含量的分析。     

高效液相色谱法测定不同产地及品种灵芝三萜类成分的含量

【目的】建立同时测定灵芝子实体中灵芝酸C_2、灵芝酸B、灵芝酸A、灵芝酮三醇、灵芝酸DM、灵芝酸T、灵芝醇B、灵芝酸S、灵芝酸G、灵芝酸F、灵芝酸D、灵芝稀酸B12种三萜成分的高效液相色谱法。【方法】选用Aglient ZORBAX SB-Aq(4.6 mm×250 mm,5μm)色谱柱,以乙腈-醋酸(0.01%)水溶液为流动相进行梯度洗脱,流速1.0 mL/min,分析波长252 nm,柱温30°C,对不同产地及品种的灵芝样品进行测定分析。【结果】同一产地不同品种间三萜类成分含量具有显著差异,不同产地的灵芝样品三萜成分含量也有显著差异,所建方法精密度高,稳定性和重复性好。【结论】所建方法适用于12种三萜成分的同时测定。     

金针菇子实体有机溶剂提取物的生物活性

分别对金针菇子实体醇提物的5个萃取分部（石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇分部和剩余分部）进行化学成分的定性检验,以及体外抗肿瘤活性和降血糖活性的筛选。定性检验结果表明,金针菇子实体的石油醚、氯仿和乙酸乙酯萃取分部中含有生物碱类、有机酸类、甾类（或三萜）、黄酮类和蒽醌类物质,正丁醇萃取分部中含有氨基酸和蛋白类、糖类、甾类（或三萜）、有机酸类和黄酮类物质,剩余分部中含有氨基酸和蛋白类、糖类、甾类（或三萜）化合物。通过药理筛选发现,金针菇子实体的石油醚、正丁醇以及剩余分部具有体外抗肿瘤作用的潜力,而氯仿和乙酸乙酯分部则具有一定的细胞毒性;各萃取分部对DPP-IV活性均具有一定的抑制作用,其中氯仿和乙酸乙酯分部的抑制作用较强。     

兴安百里香的扦插繁育试验研究

为寻求兴安百里香人工扦插繁育的适宜条件,研究了三种不同基质（校园土、细砂、珍珠岩）、两种处理（ABT生根粉溶液处理和不经处理）和三个生长期（15d,30d,40d)三因素对兴安百里香插穗的生根情况的影响。结果表明：不经生根液处理直接扦插的最佳基质为校园土;长时间（24h）ABT生根液（0.1g.L^-1)浸泡的插穗生根受到抑制,而经过0.g.L^-1ABT生根液浸渍5min插穗的校园土中在生根情况明显好于未经处理的插穗。扦插后15天的校园土中的生根率就已达到了85％,40天时达到100％。     

犬瘟热病毒小熊猫株反向遗传系统的构建及其鉴定

以驯化致弱的犬瘟热病毒小熊猫株(Canine distemper virus,CDV)为模板,构建犬痘热病毒感染性cDNA克隆.对其全基因组序列测定后,用RT-PCR的方法获得组成全长基因的7个片段,通过酶切、拼接将7段CDVcDNA序列插入到真核表达载体pCI的MCS上,构建犬瘟热病毒小熊猫株的全长cDNA质粒(pCI-CDV-LP),同时分别克隆CDV小熊猫株N、P、L蛋白ORF构建三个辅助质粒.酶切鉴定和序列测定表明,pCI载体中插入的核酶及CDV cDNA序列正确无误,使用转染试剂Lipofectamine TM 2000将全长质粒和三个辅助质粒共转染中国仓鼠肾细胞(BSR),经RT-PCR、间接免疫荧光和病毒感染VERO-SLAM细胞试验鉴定,成功拯救出CDV小熊猫株,显示CDV小熊猫株反向遗传系统构建完成,为犬瘟热病毒致病机理及免疫研究奠定基础.     

水貂犬瘟热动物模型的建立

目的建立水貂犬瘟热动物模型,并利用水貂犬瘟热模型评价不同犬瘟热强毒株的毒力,为水貂犬瘟热病毒疫苗的研究奠定基础。方法从猴、藏獒、犬的病料中分离犬瘟热病毒,测定犬瘟热病毒的毒力,并进行传代培养。利用犬的犬瘟热动物模型筛选稳定的犬瘟热强毒株,进行水貂犬瘟热动物模型的建立及其毒力评估。结果筛选出了稳定的犬瘟热强毒株并进行了家犬动物实验,同时表现出了强烈的临床症状,并利用不同的代次毒进行了犬瘟热动物模型的建立。结论成功建立了犬瘟热动物模型并对不同来源的犬瘟热病毒毒力进行了评估。     

虫草素高产菌株的筛选及菌丝体中核苷类成分的分析

用高效液相色谱对摇瓶培养获得的19个虫草属菌株的菌丝体及胞外液中核苷类成分进行了分析比较。结果表明,菌丝体中含有的核苷种类较多,且不同菌株菌丝体核苷类成分含量差异显著,而胞外液中的核苷主要为虫草素。同时发现虫草素主要分泌到培养基中,胞外液虫草素的含量可比菌丝体中高出40倍。通过筛选,获得一株虫草素高产菌株,培养液中虫草素含量可达366mg/L。