反义寡核苷酸对丙型肝炎病毒调控基因表达的体外抑制活性研究

为探讨反义寡核苷酸对丙型肝炎病毒的抑制活性,研究和开发新型抗ＨＣＶ药物。采用ＨＣＶ５’ＮＣＲ调控荧光素酶基因的稳定表达细胞株ＨｅｐＧ２．９７０６,评价了３条针对ＨＣＶ调控基因的ＡＳＯＤＮ,即ＨＣＶ３６３,ＨＣＶ３４９及ＨＣＶ２７９。将Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ包封的ＡＳＯＤＮ与ＨｅｐＧ２．９７０６细胞株每天作用５小时,连续３天后检测荧光素酶活性。     

HCV5NCR转基因细胞模型的建立

缺乏合适的ＨＣＶ感染细胞及小动物模型,是抗ＨＣＶ药物研究和开发的主要障碍之一。建立一种ＨＣＶ５ＮＣＲ调控荧光素酶基因的转基因细胞模型,可为以ＨＣＶ５ＮＣＲ及Ｃ基因５’端为靶的反义寡核苷酸及特异性核酶等抗ＨＣＶ药物的评价及筛选创造条件。     

后路椎体间融合术与经椎间孔入路腰椎融合术治疗退行性腰椎滑脱症的疗效对比及对AGEs、IL-6的影响

摘要 目的：探讨后路椎体间融合术与经椎间孔入路腰椎融合术治疗退行性腰椎滑脱症的疗效对比及对晚期糖基化终末产物（AGEs）、白细胞介素6（IL-6）的影响。方法：选择2019年1月-2019年12月在我院接受治疗的100例退行性腰椎滑脱症患者,根据手术选择方式分为观察组（n=51）和对照组（n=49）。对照组给予后路椎体间融合术(PLIF)治疗,观察组给予经椎间孔入路腰椎融合术(TLIF)治疗。比较两组患者的临床优良率、血清AGEs、IL-6、手术情况、视觉模拟评分（AVS）、Oswestry功能障碍指数（ODI）评分变化情况及并发症发生情况。结果：治疗后,两组总优良率分别为90.20%,71.43%,差异显著（P<0.05）;观察组手术时间、术中出血量、术后引流量及卧床时间均显著低于对照组,差异显著（P<0.05）;治疗前,两组血清AGEs、IL-6水平无明显差异;治疗后,两组血清AGEs水平均显著降低,且观察组低于对照组,IL-6水平显著上升,观察组低于对照组（P<0.05）;治疗前,两组AVS、ODI评分水平无明显差异;治疗后,两组AVS、ODI评分水平均显著降低,且观察组低于对照组（P<0.05）;两组并发症总发生率为3.92%、18.37%,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论：在退行性腰椎滑脱症患者中应用经椎间孔入路腰椎融合术临床效果更好,术后AGEs、IL-6水平更低,且并发症较少。     

环境因子对竹子开花影响研究

四川雅安地区刺竹和水竹开花年(2001～2006年)1月均温分别高出未开花年(1985～2000年)和多年(1985～2006年)平均值0.29℃和0.225℃;7月均温分别高出未开花年和多年平均值0.958℃和0.697℃;开花年年降水量分别比未开花年和多年平均值少124.9 mm和90.8 mm.开花和未开花水竹林小生境生态因子的调查显示,处于阳坡、光照条件好的样地开花明显多于处于阴坡、光照条件较差的样地;林内温度和湿度与竹子开花显著相关,开花样地内早上9时和中午2时平均温度和湿度均比未开花样地高.表明充足的光照、较高的林内温度、湿度,干旱和气温的升高在一定程度上起到了诱导和促进竹子开花的作用.     

肝细胞靶向pH敏脂质体介导的硫代反义寡核苷酸对HCV5‘NCR基因表达的抑制作用

反义寡核苷酸是一种阴离子大分子物质,细胞生物利用度较低且易被细胞溶酶体酶降解,为了增强反义药物在病变靶细胞内的有效浓度,根据受体介导的内吞作用原理,针对肝细胞专一性表达的去唾液酸糖蛋白受体,设计及制备了一种肝靶向性脂质体,这种脂质体同时具有pH敏性.采用竟争抑制实验及鸡红细胞溶血实验分析了其肝细胞靶向性及pH敏性;应用肝靶向pH敏脂质体作为药物运载工具,介导反义寡核苷酸HCV363作用于转基因细胞HepG2.9706细胞,通过荧光素酶活性检测,观察了硫代反义寡核苷酸对HCV 5′NCR调控功能的抑制活性.结果显示,不同浓度半乳糖溶液对5%18-gal脂质体有一定的抑制作用,浓度超过20mmol/L时,达到饱和,最大抑制率为38%;溶血实验显示脂质体与红细胞膜融合作用有显著的pH值依赖性,pH＜6时,血红素释放量明显增加;肝靶向pH敏性脂质体介导的HCV363对HepG2.9706细胞中HCV 5′NCR调控基因具有显著的剂量依赖性抑制作用,浓度为1.0umol/L时,抑制率达86%.综上,所制备的脂质体具有一定的肝细胞靶向性及显著的pH敏感性,这种脂质体能够增强HCV特异性硫代反义寡核苷酸的细胞内抑制活性,这为针对肝炎病毒的反义寡核苷酸的体内活性评价提供了有用的转运体系.     

酵母细胞表面展示载体的构建及功能验证

目的:构建酵母细胞表面展示载体。方法:通过酶切连接方法在pADH1载体中插入信号肽、α-凝集素(含连接子)编码序列构建表面展示载体,并用EGFP来验证该载体的功能。结果:得到了267 bp的信号肽序列、1 623 bp的凝集素编码序列和717 bp的绿色荧光蛋白编码序列,酵母细胞表面展示载体被成功构建,且绿色荧光蛋白被插入到pADH1-agg中后,阳性转化子能在荧光显微镜下呈现绿色荧光。结论:这说明酵母细胞表面展示载体已经构建成功,并能成功表达和展示蛋白在酵母细胞表面。该载体的构建成功将为利用酵母表面展示系统表达和展示相关蛋白提供了平台。     

复合探针荧光定量PCR方法的建立

为了对特定基因进行实时检测,根据荧光能量转移(FRET)原理,设计及合成了一种新的FRET复合探针,该探针由一条长的荧光杂交探针和短的淬灭探针构成,其中荧光探针5′端接一荧光素分子,3′端接一延伸阻断分子磷酸,淬灭探针3′端连接一个淬灭分子对甲基红,淬灭探针与荧光探针5′端互补,无模板时,该探针杂交形成复合探针。无荧光产生,当有模板时,荧光探针与模板杂交,荧光不能被淬灭,产生的荧光与模板量成正比。根据复合探针的反应原理,研究了该探针的FRET性质及影响因素包括淬灭探针及扩增片段长度、荧光探针与淬灭探针的合适比例及镁离子浓度。实验结果显示淬灭探针及扩增片段长度对复合探针的作用有明显的影响,本实验采用淬灭探针长21个核苷酸,扩增片段长127bp,荧光探针与淬灭探针的合适比例为1：1,镁离子浓度为3mmo1／L,可获得最佳的反应体系;该复合探针合成简单,淬灭彻底,具有良好的准确性与特异性,敏感性达10^2拷贝,并具有较宽的动力学定量范围,可对10^2—10^9拷贝范围内的待检样品进行准确的定量。复合探针技术可应用于病毒感染水平、转基因拷贝数及单核苷酸多态性等检测。