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豌豆来源的毒性抗虫白蛋白cDNA在毕赤酵母中异源表达及抗虫毒性分析 总被引:1,自引:0,他引:1
一种来源于豌豆的白蛋白 (PA)对多种昆虫具有明显的毒性作用 .为了进一步研究其抗虫机理 ,采用基因工程的方法富集蛋白质 .将该白蛋白基因克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA .并导入毕赤酵母菌GS115中表达 .通过PCR和Northern印迹法分析基因的整合及转录 ,对工程菌进行发酵 ,采用两步培养 :第一步富集菌体 ,第二步甲醇诱导工程菌表达重组蛋白 ,并分泌到培养基中 .经过超滤和HPLC分离 ,重组抗虫白蛋白得率约 10mg L .重组蛋白对象鼻虫敏感株表现出很强的毒力 ,半致死剂量LC50 为 4 7,与直接纯化于豌豆种子的白蛋白毒力一致 ,而对象鼻虫抗性株无明显毒力 . 相似文献
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缺血性脑卒中患者同型半胱氨酸代谢相关酶基因突变的研究 总被引:4,自引:0,他引:4
为研究同型半胱氨酸代谢相关酶亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因C677T和胱硫醚-β-合成酶(CBS)基因T833C位点碱基突变与缺血性脑卒中的关系,对74例缺血性脑卒中患者和83例健康对照者,采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术检测MTHFR基因C677T基因型,用扩增阻滞突变体系法(ARMS)检测CBS基因T833C突变。实验检出患者组MTHFR基因T纯合基因型、杂合基因型和T等位基因频率分别为2.7%、51.4%和28.4%,对照组分别为1.2%、39,8%和21.1%。患者组CBS基因C纯合基因型和C等位基因频率分别为13.5%和43.9%,对照组分别为6.0%和38.0%。Multiple Logistic Regression分析显示;C677T位点T等位基因,T833C位点C等位基因以及年龄均与缺血性脑卒中发病有关(P<0.05),C677T位点T等位基因的比值比(OR)为1.74(95%CI 1.06~2,B6)和T833C位点C等位基因的比值比为1.73(95%CI 1.07~-2.81)。实验显示MTHFR C677T和CBS T833C基因位点突变与缺血性脑卒中发病有关,上述两个基因位点突变可能是缺血性脑卒中发病的遗传因素。 相似文献
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RNase P核酶对人巨细胞病毒UL54基因mRNA体外切割作用 总被引:2,自引:0,他引:2
外部引导序列(EGSs)是mRNA靶序列互补并引导RNase P切割的小RNA片段.我们设计与人巨细胞病毒HCMV(Human Cytomegalovirus) UL54基因mRNA序列互补的EGSs,将其与大肠杆菌来源RNase P催化核心M1 RNA构建成M1GS核酶.通过对UL54基因亚克隆片转录产物体外切割研究,证实该核酶具备对UL54 mRNA片段的特异切割能力,可以发展成为一种抗病毒试剂. 相似文献
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设计表达了四个锌指核酸酶,用于切断人基因组中的rRNA基因家族的内部转录间隔序列,造成双链断裂,以此提高针对多位点基因打靶的效率,为后续基因打靶应用于基因治疗研究奠定基础。首先,在人rRNA基因家族ITS1序列中找到两个合适的9 bp长的序列(中间间隔6 bp)为锌指蛋白识别位点,根据识别位点序列每个位点分别设计两个三锌指蛋白。通过设计引物进行重叠延伸PCR得到全长编码锌指蛋白的DNA,分别克隆到表达载体pET-28a(+),构建重组质粒pET28a-ZFP,转化大肠杆菌RossettaTM(DE3),实现带组氨酸标签的锌指融合蛋白的表达与纯化。同时,将限制性内切酶Fok I的切割结构域分别与四个锌指蛋白序列采用PCR拼接后克隆到表达载体pET-28a(+),构建重组质粒pET28a-ZFN,转化到大肠杆菌RossettaTM(DE3),实现带组氨酸标签的锌指核酸酶融合蛋白的表达并纯化。 相似文献
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用Bio-Rad生产的基因脉冲仪进行酿酒酵母电击转化实验,得到的最适条件为:5kv/cm25μF和200Ω。电击后涂布前的培养时间为2小时。电击后细胞存活率为46%时,每微克质粒DNA得到106以上的转化子。用相同的质粒和受体菌进行原生质体法和醋酸锂法比较实验,转化率分别为2×104和3.5×102个转化子/μgDNA。电击转化是最方便易行和高效率的方法。 相似文献
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小鼠MDFIC(MyoD family inhibitor domain containing) 蛋白是一个新近发现的与HIC(Human I-mfa domain containing protein)高度同源的转录调控因子,可能在肌细胞的分化过程中起着重要的作用。为了深入研究MDFIC的功能,首先要制备抗MDFIC的多克隆抗体。首先采用PCR方法扩增出编码MDFIC的cDNA片段,然后将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-3, 并在大肠杆菌BL21中进行诱导表达。SDS-PAGE 和Western blotting 检测鉴定表达产物。亲和层析技术对融合蛋白进行纯化,纯化后的目的蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体。间接ELISA检测抗体效价达1∶640 000以上,检测证明抗体效价较高。此外, Western blotting结果显示, 该抗体可特异性识别真核细胞外源性及内源性的MDFIC蛋白。MDFIC多克隆抗体的成功制备为进一步研究MDFIC的功能以及进一步探索肌细胞的发生分化机制提供了重要工具。 相似文献