弗氏志贺菌5a 型 M90T 株 ClpB 蛋白在大肠杆菌中的融合表达和纯化

目的：构建弗氏志贺菌cZp8基因的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达后,纯化带T7标签的ClpB蛋白。方法与结果：PCR扩增得到线性化表达载体pET24a与2574bp的c加曰基因片段,利用不依赖连接反应的克隆法（LIC）进行克隆,得到重组质粒pET-ClpB,转入大肠杆菌BL21（DE3）中进行诱导表达,通过一系列条件优化,确定可溶性表达条件为在30℃下、用1mmol／LIPTG诱导2h;利用抗T7单克隆抗体琼脂糖珠进行亲和纯化,得到了纯度很高的相对分子质量为95×10^3的ClpB-T7融合蛋白。结论：实现了ClpB-T7在大肠杆菌中的可溶性表达,并纯化获得了高纯度的融合蛋白。     

哺乳动物精卵融合机制

最近基因打靶研究揭示出了参与精卵结合和融合的各种分子。精子中ADAMs因子（是含有裂解蛋白和金属蛋白酶结构域蛋白质家族）,包括繁殖因子α、繁殖因子β以及cyritestin,经过研究已经发现它们对精卵结合有重要作用,而对精卵的融合不重要。通过研究推测出其受体为卵母细胞整合蛋白,其对精卵交互作用是必需的。最近,一些研究表明CD9和卵母细胞上GPI锚定蛋白（glycosyl phosphatidyl inositol糖基磷脂酰肌醇）,以及精子上的附睾蛋白DE均是精卵融合过程中的侯选因子,如果缺乏这些蛋白质分子或其作用受到干扰将导致精卵融合机制紊乱。综述重点讨论了参与精卵交互作用的相关分子的最新研究进展。     

黑须污蝇不同发育阶段转录组及嗅觉相关基因分析

【目的】建立黑须污蝇Wohlfahrtia magnifica转录组数据库,挖掘黑须污蝇基因数据,为更深入地研究双峰驼阴道蝇蛆病提供理论依据。【方法】采用高通量测序平台Illumina HiseqTM4000对黑须污蝇幼虫、蛹和成虫进行转录组测序,并进行生物信息学分析。利用黑须污蝇幼虫、蛹和成虫转录组数据,通过基因差异表达分析以及GO功能显著性富集分析的方法筛选出嗅觉相关基因,并通过荧光定量PCR技术对黑须污蝇幼虫、蛹和成虫中OBP99b,OBP56a和OBP99a 3个嗅觉相关基因表达水平进行验证。【结果】结果显示,每个黑须污蝇样本的转录组数据量在4.96 Gb以上,G+C含量在35.35%以上,Q20含量在97%以上。与NCBInr, GO, KEGG, Pfam, Swiss-Prot和eggNOG数据库进行对比,共注释到73 303条unigenes。其中eggNOG数据库注释到的unigenes最多,为35 066条,分布在23个蛋白功能中,其中的翻译修饰、蛋白质周转的unigenes所占比例较大;GO数据库注释到的unigenes数为29 193条,功能包括分子功能、细胞组分、生物学过程三大类50个分支,其中参与生物学过程和氧化还原过程的unigenes比例较大;KEGG数据库注释到的unigenes数为15 068条,其中参与信号转导过程的unigenes比例较大。上述数据表明该转录组测序结果较好,为后续研究奠定了基础。依据黑须污蝇幼虫、蛹、成虫转录组数据筛选到30个嗅觉相关基因,其中包含9个气味结合蛋白(OBP)基因,进一步基因注释发现OBP99b,OBP56a和OBP99a基因在黑须污蝇不同发育阶段表达差异显著(|log2FC|>1,P<0.05),这在荧光定量PCR分析结果中得到了验证。【结论】本研究获得了黑须污蝇幼虫、蛹和成虫转录组数据,筛选出黑须污蝇各发育阶段嗅觉相关基因,并验证了OBP99b,OBP56a和OBP99a基因在黑须污蝇幼虫、蛹和成虫3个发育阶段差异表达,为防治双峰驼阴道蝇蛆病提供了新思路。     

固态发酵下酵母自溶的工艺优化

固态下酵母自溶可以有效促进菌体内多种活性物质的释放,进而提高酵母类产品的品质。通过优化自溶温度、自溶时间及自溶促进剂锌离子浓度以获得固态发酵下酵母自溶的最佳工艺,对固态发酵物料中游离氨基酸、可溶性蛋白、α-氨基氮含量和A260/A280等指标的分析来确定固态酵母自溶工艺条件,在此基础上以自溶温度40 ℃、50 ℃、55 ℃;作用时间12、18、24 h;锌离子添加浓度2、4、8 mg/kg设置L9(33)正交试验,进一步优化固态酵母自溶的工艺参数。结果表明酵母自溶的最佳工艺条件为：自溶温度55 ℃、作用时间18 h、锌离子浓度2 mg/kg,此时其可溶性蛋白含量可达9.31 mg/g、游离氨基酸14.36 mg/g、α-氨基氮10.16 μg/g、A260/A280为1.73。经工艺优化后,可显著提高酵母自溶产物可溶性蛋白、游离氨基酸和α-氨基氮的含量,从而明显提高了复合菌培养物的品质。     

一种蜱源性耐盐耐碱菌株Oceanobacillus oncorhynchi IMH的首次分离与鉴定

【目的】本试验以源自呼伦贝尔地区的优势蜱种草原革蜱为材料,从其体内分离得到可疑细菌,应用常规方法和分子生物学方法对该菌株进行分离及鉴定,并对其致病性进行探索,为内蒙古地区蜱虫生物多样性和环境相关性研究奠定了基础。【方法】首先,通过形态学观察,生理生化试验、药物敏感试验以及16S r RNA序列分析,并构建系统发育树,确定该菌株的分类地位;其次对昆明小鼠进行致病性实验。【结果】该菌株革兰氏染色呈G+杆菌,在高盐培养基(5%Na Cl)和p H为9的碱性培养基中生长良好;该菌对不同糖类发酵能力非常有限,只利用部分糖类(如西蒙氏枸橼酸盐试验结果为阳性)产气,但是不产酸;对个别化学药(如环丙沙星)和多数抗生素(如复方新诺明、庆大霉素、红霉素及头孢噻肟等)显示为敏感,而对抗生素卡那霉素和阿莫西林表现为耐药性;经16S r RNA基因序列和系统发育树分析发现,该菌株与GenBank数据库中已注册的多株Oceanobacillus oncorhynchi的同源性为99%以上;该菌在血平板溶血试验中呈现出不完全α溶血,而感染昆明小鼠,观察7 d无明显致病性。【结论】本试验首次分离鉴定了一株蜱源性O.oncorhynchi,并对上述菌株重新命名为O.oncorhynchi IMH,并在Gen Bank中进行注册(LC213016.1),更加丰富了Gen Bank中相关数据。     

柯萨奇病毒A16型的B1a和B1b两个分支在内蒙古自治区共同流行

研究2010年引起内蒙古自治区手足口病流行的柯萨奇病毒A组16型(Coxsackie virus A16,CVA16)的分子流行病学特征。采集内蒙古自治区12个盟市门诊就诊的888名手足口病患者粪便和咽拭子标本共921份,进行病毒分离,然后利用实时荧光PCR对阳性分离物进行CVA16的鉴定。从临床症状分别为普通型、重型和死亡病例的临床标本中分离的CVA16中随机选取50株代表株进行VP1编码区扩增及核苷酸序列测定和分析,与其他各基因型和基因亚型的CVA16构建亲缘进化关系树。921份标本共分离出82株CVA16,分离率为8.90%,其中从重症病例分离出3株CVA16,从死亡病例中分离出1株CVA16。50株内蒙古CVA16代表株在核苷酸水平上与1998年以来中国大陆CVA16分离株的同源性都较高,尤其与2009年北京株和2010年河南株的同源性最高,分别为96.18%～98.88%和94.94%～98.76%;但与2007年内蒙古流行株存在一定的差异,同源性仅为91.68%～96.52%;亲缘进化关系树显示,所有内蒙古CVA16株都属于B1基因型的两大进化分支B1a和B1b,并处于不同的簇中,它们之间的核苷酸和氨基酸同源性分别为89.99%～100%和98.31%～100%,表现为CVA16分离株属于多个病毒传播链。2010年从内蒙古自治区不同临床症状手足口病病例分离的CVA16流行株属于B1基因型的两大进化分支B1a和B1b,两个进化分支的CVA16在内蒙古自治区共同进化和流行。     

利用串联亲和纯化技术分离大肠杆菌GroEL蛋白复合物

肠出血性大肠杆菌O157∶H7是一种重要的致病菌,加深其致病机理的基础研究将为相关疫苗研究及疾病控制等提供新的思路和依据.串联亲和纯化(TAP)技术是最近发展的分离纯化天然状态蛋白质复合物进而研究蛋白质相互作用的新方法.用我们自己构建的原核表达串联亲和标签载体,在大肠杆菌O157∶H7中表达了标签融合蛋白GroEL-TAP,建立了非变性条件下制备蛋白复合物的方法,并且对串联亲和纯化过程中的相关实验条件进行了探索和优化,最终得到了高纯度的GroEL-TAP与天然GroEL形成的嵌合型多聚体复合物.这表明我们建立的串联亲和纯化技术能高度特异地纯化靶蛋白参与形成的复合物,为后续寻找O157∶H7中毒力蛋白参与形成的复合物奠定了实验基础.     

奶牛阴道菌群分析与乳酸菌的分离及鉴定

目的研究奶牛阴道菌群,并从健康奶牛阴道分离出产酸能力很强的乳酸菌。方法采用常规的方法对奶牛阴道进行细菌的分离及鉴定,并进行菌群分析。结果健康奶牛阴道优势菌群主要为乳酸菌(P<0.01),屡配不孕奶牛阴道优势菌群主要为金黄色葡萄球菌(P<0.01);从健康奶牛阴道分离出的乳酸菌为55株,其中产酸能力很强的6株乳酸菌鉴定结果分别为Lactobacillus plantarum、Lactobacillus brevis、Enterococcus faecalis、Lactococcus garvieae、Lactobacillus kitasatonis和Lactobacillus amylovorus。结论奶牛阴道菌群中分离的6株乳酸菌可作为潜在的奶牛阴道微生态制剂进行深入研究。     

丝状支原体山羊亚种PG3株的全基因组序列测定与分析

【目的】全面了解丝状支原体山羊亚种PG3株的全基因组序列信息,寻找该病原体的主要保护性抗原基因。【方法】利用高通量Illumina Hi Seq 2000测序技术对丝状支原体山羊亚种PG3株的全基因组进行测序与拼接,借助软件和数据库对全基因组序列所承载的遗传信息进行注释和分析。【结果】丝状支原体山羊亚种PG3株基因组大小为1 025 065 bp,G+C%为23.6%,预测含有846个编码基因。根据COG分类和KEGG代谢通路分类,基因组中绝大多数基因主要与蛋白翻译、核糖体结构与合成、DNA复制与修复、糖代谢和环境信号传递与转换方面有关。该菌株具有丝状支原体山羊亚种特有的麦芽糊精/麦芽糖代谢途径。与Mmc str.95010的基因组的比对结果显示二者具有良好的共线性关系。在基因组中发现3个串联排列的可变表面脂蛋白基因,即GL000459、GL000461和GL000462。【结论】获得丝状支原体山羊亚种PG3株的全基因组序列,分析基因组基本特征,初步解析3个串联排列的可变表面脂蛋白基因,为进一步研究支原体可变表面脂蛋白的功能和研制生物工程疫苗奠定基础。