3 次连续重复提取DNA 能较好反映土壤微生物丰度

【目的】研究同一个土壤需要反复提取几次才能在最大程度上反映土壤微生物的丰度,探讨风干土壤代替新鲜土壤用于微生物丰度研究的可行性。【方法】针对两种理化性质具有较大差异的旱地和稻田新鲜土壤及其风干土壤,分别对土壤微生物进行5次连续裂解提取DNA。通过实时荧光定量PCR技术分析连续反复提取对土壤古菌和细菌16S rRNA gene数量、氨氧化古菌和细菌功能基因amoA数量的影响。【结果】3次连续提取DNA占5次提取DNA总量的76%以上,氨氧化古菌、氨氧化细菌、古菌和细菌4类微生物的3次连续提取最低回收率为77.5%;与新鲜土壤相比,风干处理导致氨氧化古菌、氨氧化细菌、古菌、细菌的数量分别降低84.3%、81.2%、12.5%和90.3%,然而,2种土壤风干过程中主要微生物类群的数量变化规律基本一致,表明土壤微生物对风干处理的响应可能受土壤类型的影响较小。【结论】土壤微生物连续3次裂解能较好反映微生物丰度。与新鲜土壤相比,风干过程显著降低了土壤微生物丰度,然而,通过风干土壤中微生物丰度的变化趋势反映新鲜土壤中微生物数量变化规律具有一定的可行性。     

内蒙古岗更诺尔湖泊退化情景下好氧甲烷氧化的微生物过程研究

【目的】内蒙古岗更诺尔湖退化为碱地、草地情景下,研究好氧甲烷氧化过程及其微生物群落的变化规律。【方法】针对湖泊沉积物及其退化后形成的碱地、草地土壤,在不同初始甲烷浓度下培养,研究其甲烷氧化速率,通过实时荧光定量PCR、高通量测序技术分析甲烷氧化菌的群落构成及其变化规律。【结果】湖泊退化过程中,沉积物和碱地的土壤理化性质、甲烷氧化速率变化规律基本一致,但与草地土壤有显著差异。在微生物属水平,甲烷氧化菌Methylococcus的丰度显著增加,在沉积物、碱地和草地中的丰度分别为19.2%、48.8%和78.3%,而Crenothrix的丰度明显降低,依次为54.7%、32.1%、和13.9%。进一步室内模拟不同初始浓度下甲烷氧化过程,发现沉积物中Crenothrix和Methylocaldum的增幅最大;碱地土壤中Methylococcus和Methylomonas的增幅远高于其他甲烷氧化菌;而在草地土壤中,Crenothrix增加高达7.81%,增幅达196倍。这些显著增加的微生物可能在不同浓度甲烷氧化过程中发挥了重要作用。【结论】湖泊退化过程中,甲烷氧化潜力降低。沉积物中的甲烷氧化菌发生了显著分异,Methylococcus逐渐成为碱地和草地的优势微生物,而Crenothrix则逐渐成为弱势类群。然而,草地土壤氧化高浓度甲烷过程中,数量上占弱势的Crenothrix迅速变为优势类群,可能发挥了重要作用。     

典型草地土壤好氧甲烷氧化的微生物生态过程

【目的】针对我国甘肃三个典型生态区草地土壤(玛曲MQ、临泽LZ和环县HX),研究其甲烷氧化潜力、甲烷氧化菌(methane-oxidizingbacteria,MOB)丰度及可能存在的群落分异规律。【方法】通过原位分析、室内高浓度甲烷模拟培养三种典型土壤及实时荧光定量、高通量测序的方法研究甲烷氧化菌标靶基因pmoA序列的组成及其丰度变化规律。【结果】三种典型草地土壤的原位甲烷氧化菌的丰度存在显著差异,表现为MQ>HX>LZ,其数量范围为为0.18–6.86×10^7g/d.w.s.;甲烷氧化潜力也表现出类似规律,其通量为109–169mg/(m^2·h);甲烷氧化潜力与原位土壤中甲烷氧化菌丰度有正相关。三种草地土壤甲烷氧化菌存在明显的空间异质性,采用高通量测序的方法,发现三种草地原位土壤中的优势类群为USCγ(Upland Soil Cluster gamma,USCγ);然而,室内高浓度甲烷氧化过程中,传统的甲烷氧化菌均发生明显增加,MQ土壤中TypeⅡ的Methylocystis为优势类群,而LZ和HX土壤的优势类群均为TypeⅠ型Methylosarcina。【结论】这些研究结果表明,我国甘肃典型草地土壤中也存在难培养的大气甲烷氧化菌和经典的可培养甲烷氧化菌,这些微生物极可能氧化极低浓度的大气甲烷,也可能利用闭蓄于土壤中的高浓度甲烷生长。未来应采用先进技术原位观测大气甲烷氧化过程并分离相应微生物类群,研究草地土壤甲烷氧化菌地理分异规律及其环境驱动机制。     

水稻土中紫色光合细菌沿纬度梯度的空间分异特征

紫色光合细菌由于其代谢途径的多样性,在环境中广泛分布,是生态系统中碳循环的参与者和推动者之一。但是,水稻土中紫色光合细菌群落结构的空间分异却鲜有报道。基于此,沿我国温度梯度带(纬度梯度:28.38°N—47.43°N),采集了8个典型水稻土,利用PCR-DGGE指纹图谱和系统发育树分析揭示不同地点水稻土中紫色光合细菌群落的组成;结合多个环境因子,利用生物信息学,典范对应分析(Canonical Correspondence Analysis,CCA)和最小判别效应分析(Cladogram,LDA)明确水稻土中紫色光合细菌的空间分异规律。研究发现我国8个典型水稻土中紫色光合细菌主要由变形菌门(Proteobacteria)的α和β这两个分支组成,主要为紫色非硫细菌;p H和纬度都是驱动水稻土中紫色光合细菌群落结构分异的关键因子。该认知不仅有助于更好地揭示稻田关键功能微生物群的生物地理学分布,还有助于进一步探究我国稻田生态系统有机质转化的时空差异。     

单细胞、显微计数和高通量测序典型水稻土微生物组的技术比较

【目的】比较传统显微计数、单细胞分选和现代分子方法研究典型水稻土微生物组的细胞数量、物种组成及好氧甲烷氧化菌生理生态过程的技术特点。【方法】针对水稻土中可提取微生物细胞(土壤细胞)及其DNA(细胞DNA)、单细胞DNA、土壤微生物组总DNA(土壤DNA),利用传统显微计数和实时荧光定量PCR(qPCR)方法,研究水稻土好氧甲烷氧化过程中微生物数量的变化规律;通过高通量测序16S rRNA基因技术,研究微生物物种组成的变化规律。【结果】水稻土微生物组的传统显微计数结果显著低于现代分子方法 qPCR,最高可达3个数量级。基于DAPI染色、CARD-FISH、细胞DNA及土壤DNA的qPCR定量结果分别为:(5.8–7.4)×10~7、(1.7–1.9)×10~7、(2.8–6.3)×10~8、(1.5–2.7)×10~(10) cells/g。基于qPCR的水稻土好氧甲烷氧化菌数量为1.1×10~7 cells/g,比传统显微计数方法高3个数量级。然而,当水稻土氧化高浓度甲烷后,所有方法均发现甲烷氧化菌显著增加,增幅分别为54倍(CARD-FISH)、388倍(细胞DNA)和45倍(土壤DNA)。在微生物分类学门的水平,细胞DNA(25个门)与土壤DNA(30个门)结果基本一致,均能较好地反映水稻土微生物组的群落结构,而单细胞DNA尽管检测到20个门,但偏好性较大,95%以上均为Proteobacteria。在微生物分类学属的水平,土壤DNA、细胞DNA和单细胞DNA分析均表明背景土壤含有7个好氧甲烷氧化菌的pmo A基因型,但氧化高浓度甲烷后,γ-Proteobacteria的2个属Methylobacter/Methylosarcina则成为优势类群。【结论】土壤微生物的传统显微计数(DAPI和CARD-FISH)结果显著低于qPCR技术,相差1–3个数量级。qPCR定量土壤DNA和细胞DNA表明:水稻土可提取微生物细胞约占土壤微生物总量的2%左右,而好氧甲烷氧化菌的提取效率最高可达6%。细胞DNA在门水平能较好地反映水稻土微生物组成,但在属水平和土壤DNA有着较大差异。Planctomycetes微生物门的细胞易被提取,Acidobacteria门的微生物则较难被提取,而单细胞分选技术则偏好Proteobacteria。尽管传统方法和分子技术的分辨率明显不同,但均能较好地表征水稻土甲烷氧化的微生物生理生态过程。未来土壤微生物组研究应更加重视科学问题本身对技术手段的内在需求,最大限度发挥各种先进技术的优势。