钝齿棒杆菌的代谢改造：L-鸟氨酸与L-瓜氨酸合成菌株的构建

【目的】对一株产L-精氨酸的钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYPA5-5进行代谢工程改造,构建L-鸟氨酸和L-瓜氨酸合成菌株,并考察其发酵生产相应氨基酸的性能。【方法】分别敲除菌株SYPA5-5鸟氨酸氨甲酰转移酶(Ornithine carbamoyltransferase,OTC)的编码基因argF和精胺琥珀酸合成酶(Argininosuccinate synthase,ASS)的编码基因argG,构建能够合成L-鸟氨酸及L-瓜氨酸的重组菌株SYPA5-5△argF和SYPA5-5△argG;考察不同营养条件对上述重组菌株生长和相应氨基酸积累的影响。【结果】添加0.3 g/L L-精氨酸可满足SYPA5-5△argF的生长及L-鸟氨酸积累所需,L-鸟氨酸产量可达21.5 g/L;添加L-精氨酸有利于SYPA5-5△argG的生长,但不利于L-瓜氨酸的积累;不添加L-精氨酸时,L-瓜氨酸产量可达15.2 g/L,同时积累6.8 g/L的L-谷氨酸。【结论】分别敲除L-精氨酸生产菌株SYPA5-5的argF及argG基因,可实现L-精氨酸合成途径的中间代谢物L-瓜氨酸和L-鸟氨酸的积累,拓展了该菌株的工业应用范围。     

重组瑞替普酶在毕赤酵母中的表达

【目的】瑞替普酶(重组组织纤溶酶原激活物,rt PA)被认为是第三代安全有效的溶栓剂,以p PIC9K为载体,以3种不同表型的毕赤酵母(Pichia pastoris)为宿主,探索适合rt PA分泌型表达的最佳体系。【方法】以质粒p ET28a-rt PA为模板,设计特异性引物,PCR扩增目的基因rt PA,插入分泌型表达载体p PIC9K中,获得重组表达质粒p PIC9K-rt PA。重组质粒经限制性内切酶Sal I线性化后,电击转化至3种不同表型的P.pastoris(GS115、SMD1168、KM71)中进行组成型表达;重组表达体系进行甲醇诱导表达,对产物进行Western blot鉴定,并采用纤维蛋白平板溶圈法测定其活性。【结果】重组蛋白分子量约为43 k D;rt PA-GS115和rt PA-KM71均在39 k D处有特异性条带,且前者在32 k D处有轻微降解条带,而后者并无此现象;rt PA-SMD1168无降解现象,且rt PA-SMD1168比活性较rt PA-GS115高27%;rt PA-KM71表达量和活性均为最低。【结论】从重组蛋白生物活性出发,P.pastoris SD1168可作为rt PA的最佳表达体系,在控制宿主蛋白酶活性、减少产物降解的前提下,P.pastoris GS115也是rt PA表达的优选体系。     

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶介导的草酰乙酸回补途径对谷氨酸棒杆菌V1氨基酸代谢的影响

【目的】谷氨酸棒杆菌是工业生产氨基酸的主要菌株,以缬氨酸高产菌株谷氨酸棒杆菌V1为研究对象,探讨磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PCK)介导的草酰乙酸回补途径对菌株生理特性以及主要氨基酸代谢流量的影响。【方法】通过基因工程手段,在谷氨酸棒杆菌V1中过表达pepc(编码PEPC)和pck(编码PCK),比较重组菌与出发菌关键酶活性、发酵特性以及主要氨基酸积累量变化。【结果】构建两株重组菌V1-pepc(强化草酰乙酸回补途径)和V1-pck(弱化草酰乙酸回补途径),重组菌生长均较出发菌延缓,总生物量、葡萄糖和硫酸铵消耗基本不变;过表达pck,PCK活性提高22.8%,丙氨酸、缬氨酸、谷氨酸、精氨酸积累量分别提高了11.8%、17.2%、27.8%和19.5%;过表达pepc,PEPC活性提高27.5%,同时PC活性降低12.9%,天冬氨酸族和谷氨酸族氨基酸的整体流量变化不大,丙氨酸族氨基酸的整体流量降低了14.7%。【结论】丙氨酸族氨基酸受此回补途径影响较大,天冬氨酸族氨基酸受此影响较小。     

响应面法优化深层发酵樟芝总三萜的提取工艺(英文)

采用响应面法对樟芝深层培养中总三萜的提取工艺进行优化。根据Box-Benhnken的中心组合实验设计原理,在单因素实验的基础上,选取溶剂浓度、提取温度和液固比为变量,应用响应面法进行三因素三水平的实验设计。以总三萜得率作为响应值,建立了樟芝总三萜提取的回归模型,对其提取条件进行进一步优化。结果表明,优化的总三萜提取条件为乙醇浓度86%,提取温度75℃,液固比37。进一步的实验也验证了该模型的有效性。     

钝齿棒杆菌乙酰谷氨酸激酶编码基因argB的克隆表达、纯化及酶学性质研究

本研究的钝齿棒杆菌(Gorynebacterium crenatum SYPA)是筛选得到的高产精氨酸突变菌株,其中argB基因编码的乙酰谷氨酸激酶(NAGK)是精氨酸合成过程中的关键酶。为了进一步研究该酶的相关特性,以钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum SYPA)基因组为模板,扩增得到其arB基因,成功构建了pET-28a-argB重组质粒,并在E.coli BL21(DE3)中诱导后高效表达。利用载体pET-28a上的His6·Tag标记选用Ni柱亲和层析法纯化表达具有活性的NAGK,纯化后酶的比活力达到7.28 U/mg,纯化倍数达66.18。并对该酶的酶学性质进行了初步研究,该酶的最适反应温度为30℃;最适pH值为9.0;酶学动力学参数以N-乙酰谷氨酸为底物的Km为3.35mmol/L;金属离子Cu~(2+)、Mn~(2+)、螯合剂对乙酰谷氨酸激酶均有明显的抑制作用。     

L-精氨酸高产菌的选育及基于代谢流量分布的育种机制

从分析钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)的精氨酸合成途径入手,提出了一种通过选育脯氨酸结构类似物抗性突变株以提高其精氨酸合成能力的育种思路。采用亚硝基胍(NTG)诱变处理出发菌株YD8(His-,SGr1.2 mg/mL,D-Argr15 mg/mL),经含15 mg/mL的脯氨酸结构类似物S-甲基半胱氨酸(S-MC)的抗性筛选获得精氨酸高产突变株YDM403(His-,SGr1.2 mg/mL,D-Argr15 mg/mL,S-MCr15 mg/mL),产酸水平可达29.4 g/L,较出发菌株YD8的产酸高出55.0%。通过代谢流量分布分析了菌株YD8和YDM403代谢网络的变化,结果表明,菌株YD8可能存在顺序反馈抑制作用,出发株YD8解除了Arg对Glu到Arg的反馈抑制,而YDM403又解除了Pro对Glu到Pro的反馈抑制,从而使中间物Glu累积量下降而对-αKG到Glu不再有反馈抑制,其通量提高,与此同时从Glu向Arg的代谢通量也相应增加。     

微生物糖基转移酶催化合成槲皮素糖苷及其抗炎活性评价

利用微生物来源的糖基转移酶GT-1、GT-2和BTGT-1对槲皮素进行糖基化修饰。研究发现这3种酶均能够催化以槲皮素和UDP-葡萄糖为底物生成槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖（异槲皮苷）,GT-1、 GT-2和BTGT-1催化反应的产物生成率分别为5.33%、15.18%和63.82%。通过对槲皮素、异槲皮苷和槲皮素-N-乙酰-D-氨基葡萄糖进行水溶性以及体外细胞抗炎活性检测,发现槲皮素经糖基化后其水溶性得到较大提高,异槲皮苷和槲皮素-N-乙酰-D-氨基葡萄糖水溶性分别是槲皮素的13.8倍和15.4倍。同等浓度下槲皮素糖苷对RAW264.7 细胞的毒性作用低于槲皮素,且3种化合物在一定浓度范围内对LPS诱导RAW264.7细胞释放NO、 IL-1β、IL-6 都有显著的抑制作用,且呈剂量依赖性,研究表明3种化合物都具有一定的抗炎作用。     

产L-丝氨酸菌株SYPS-062的鉴定及碳源对发酵的影响

采用形态学、生理生化实验和16S rDNA序列分析的方法对从自然界中筛选得到的一株能直接利用糖质原料发酵生产L-丝氨酸菌株SYPS-062的分类地位进行了研究, 确定其为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。同时考察了碳源对菌株SYPS-062发酵产L-丝氨酸的影响, 实验结果表明, 当蔗糖浓度为60 g/L时, 菌株SYPS-062生物量和L-丝氨酸的积累均达到最大值, 分别为8.1 g/L和6.6 g/L。     

嗜盐脂肪酶产生菌的筛选及其粗酶性质

从内蒙古锡林浩特地区盐湖菌种样品分离获得一株嗜盐脂肪酶高产菌, 结合生理生化试验和16S rDNA序列分析结果, 鉴定并命名为Haloterrigena thermotolerans Z4。该菌最适生长NaCl浓度为3.5 mol/L, 最高生长温度为60°C, 属于嗜盐耐热古生菌。粗酶性质研究表明, 金属离子(Ba2+、Fe2+、Cu2+)对酶有激活作用, 酶活不同程度的提高了20%~30%; 该酶受EDTA的抑制, 酶活下降了20%, 受PMSF的完全抑制。该酶对NaCl有较高的依赖专一性, 至少需要0.5 mol/L NaCl维持活性并且高浓度NaCl可以提高其耐热水平。醇类物质对于提高酶的热稳定性有一定作用, 丙三醇效果最好。该酶对短链底物对硝基苯酚丁酸酯(p-NPB)的最适水解条件为：pH 8.0、70°C、3.5 mol/L NaCl; 而对长链底物对硝基苯酚十六酸酯(p-NPP)的最适水解条件为：pH 8.0、80°C、2.5 mol/L NaCl。     

产3-羟基丙酸重组菌的构建及其转化甘油的研究

将连接编码甘油脱水酶的基因重组质粒pEtac-dhaB和连接编码乙醛脱氢酶编码基因aldh的重组质粒pUCtac共转化大肠杆菌,得到产3-羟基丙酸重组大肠杆菌JM109(pUCtac-aldh,pEtac-dhaB),并对影响该重组菌发酵的营养因子进行研究.试验结果表明:该重组菌转化甘油合成3-羟基丙酸的适宜培养基组成为甘油40 g/L、酵母膏6 g/L、维生素B12 0.02 g/L以及KH2PO4 7.5 g/L; 3-羟基丙酸产量和转化率分别达到4.92 g/L和12.3 %.