斑马鱼整体原位杂交的技术改良

斑马鱼整体原位杂交技术广泛应用于基因表达谱、基因间相互关系和突变体筛选等方面,是研究斑马鱼发育相关基因功能的重要技术。本文从杂交探针的制备、浓度的选择和洗脱以及胚胎的脱色、蛋白酶K消化、底物显色等方面进行了摸索、改进及简化,获得了背景低、着色清晰、特异性高的实验结果,预示了简单实用、成本低廉的斑马鱼整胚原位杂交技术平台的成功建立。     

小鼠Lbh抗体的制备和鉴定

利用小鼠作为模式动物进一步研究人类Lbh（Limb—bud—and—heart）在心脏发育中的功能。提取正常成年小鼠的心脏总RNA,RT—PCR扩增小鼠Lbh的全长开放阅读框,构建原核表达重组质粒pGEX4T-1-Lbh。转化大肠杆菌BL21后,摇菌培养到OD600为0．5～0．6时,加IPTG诱导融合蛋白的表达。将纯化的GST—Lbh融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。免疫印迹法检测表明该抗体有较好的特异性,可用于该基因结构和功能的研究。     

Nulp1基因抑制P19CL6细胞向心肌细胞分化

Nulp1基因是已克隆的一个新的bHLH转录因子亚家族成员.前期的研究表明：Nulp1蛋白作为一个转录抑制子对SRF信号途径有极强的抑制作用.为了进一步研究Nulp1基因在心肌分化中的作用,在能够高效分化为心肌细胞的P19CL6细胞系中过表达Nulp1基因,发现心肌分化标志基因的表达被抑制;用RNA干扰技术,使Nulp1基因在P19CL6细胞系中的内源表达降低,发现心肌分化标志基因的表达提高,说明Nulp1基因能够抑制P19CL6细胞系向心肌细胞的分化.     

人类成肌发育候选基因ASB12 RNAi稳定细胞系的构建与鉴定

目的:利用siRNA表达载体构建抑制人类成肌发育候选基因ASB12表达的pSUPER RNAi载体(pSU-PER-ASB12),筛选构建C2C12-pSUPER-ASB12稳定表达细胞系。方法:化学合成一对编码短发夹RNA序列的、靶向成肌发育候选基因ASB12的寡核苷酸链60个碱基,退火,克隆到经BglⅡ、XhoⅠ双酶切的pSUPER质粒上,构建重组RNAi质粒(pSUPER-ASB12)。通过酶切鉴定及测序分析检测构建效果。将正确构建的质粒转染小鼠骨骼肌细胞C2C12,通过G418筛选,免疫荧光检测,RT-PCR分析,建立稳定表达pSUPER-ASB12的细胞系C2C12-pSUPER-ASB12。结果:pSUPER-ASB12载体经酶切鉴定及测序分析,结果表明60个碱基成功插入到预计位点,并且序列完全一致。C2C12-pSUPER-ASB12稳定表达细胞系可表达绿色荧光蛋白,RT-PCR检测结果显示C2C12-pSUPER-ASB12细胞中ASB12表达量明显降低。结论:靶向ASB12的pSUPER RNAi载体和C2C12-pSUPER-ASB12稳定表达细胞系构建成功,为进一步从分子水平探讨ASB12在成肌发育中的功能奠定了基础。     

促炎因子在心脏修复中的作用

肿 瘤 坏死 因 子 TN F)、白介 素 -1(IL-1)、白 介 素 -2(IL-2)以 及 白介 素 -6(IL-6)等 分子 ,叫 作 促 炎细 胞 因 (子 .一 般 认为 它 们不 属于 免 疫系 统,而 只是 与 组织 炎症 的起 始 有关 .促 炎因 子在 心 脏中 也 有表 达,它 的短 期表 达可 以 帮助 心 脏适 应外 界 压力 的损 伤 ,而其 长期 的 表达 却会 引 起明 显的 心 脏代 谢失 常 .主要 就 促炎 因子 在心 脏中 的 作用 作 一综 述 .     

hLBH的转录活性及其在MAPK信号转导途径中的作用

hLBH是一个人类心脏发育相关的候选基因,研究了hLBH的转录活性及其在MAPK信号途径中的作用.荧光素酶检测实验表明hLBH是一个转录激活因子.基因结构分段实验证明hLBH的两个模体在调节转录激活中起着重要的作用.将hLBH蛋白分别与SRE和AP-1共转染之后激活了SRE和AP-1的活性.这些结果表明hLBH可能通过MAPK信号途径来介导细胞功能.     

非甾体抗炎药抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖

本文研究了aspirin、ibuprofen和sulindac三种不同结构的非甾体抗炎药(NSAID)对大鼠A10血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的影响并探讨其作用机制。方法:细胞计数法观察不同浓度的三种NSAID对细胞增殖的影响,乳酸脱氢酶(LDH)释放分析法测定NSAID的细胞毒作用,流式细胞术分析测定细胞周期。结果:aspirin、ibuprofen和sulindac三种NSAID都对A10 VSMC的增殖有明显抑制作用,且其作用是浓度依赖性的,IC_(50)分别是:aspirin为1666μmol/L,ibuprofen为937μmol/L,sulindac为520μmol/L;其抑制作用不是因细胞毒作用引起;三种NSAID对细胞周期的作用不同,ibuprofen(1000μmol/L)和sulindac(750μmol/L)将细胞阻抑在细胞周期的G_1期(从68.7±2.0%上升到76.6±2.2%和75.8±2.2%,P<0.05),而aspirin(2500μmol/L)对处于细胞周期各期的细胞百分率无明显改变;利用有丝分裂抑制剂nocodazole辅助分析,更清楚地检测到了ibuprofen和sulindac在G_1阻抑,而aspirin仍然不引起处于细胞周期各期的细胞百分率的明显改变。结论:aspirin抗A10 VSMC的增殖作用机制与ibuprofen和sulindac两者的作用机制不同,本研究为三种NSAID成为VSMC增殖性疾病的治疗药物提供了理论依据。     

锌指亚家族GATA-4、-5和-6的调控作用

GATA蛋白是一类重要的转录调节因子,它们具有保守的DNA结合结构域,其中的GATA 4、 5和 6亚家族对组织特异性基因的表达起关键性的调控作用.综述了这3种因子的结构功能,在小鼠中的表达模式和基因定位,在组织特异性基因表达中的作用,对可诱导基因表达的调节以及与它们相互作用的有关因子等.     

SDHB蛋白的表达、纯化及多克隆抗体制备

SDHB(succinate dehydrogenage complex,subunit B)基因可能介导呼吸链生物功能和调控细胞生长.采用PCR技术扩增出SDHB基因,并将其连接到pGEX-4T-1原核表达载体中,经酶切及测序鉴定后,转化BL21细菌,并用IPTG诱导表达融合蛋白,谷胱甘肽琼脂糖珠亲和纯化,将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western blot检测抗体.获得了SDHB原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗SDHB多克隆抗体,为SDHB进一步的功能研究奠定了基础.     

人类锌指蛋白ZNF382对肌生成的调控作用

人类基因组中有大量哺乳类特有的KRAB锌指基因,这些基因的功能大多尚不清楚,ZNF382就是其中一个.本文研究了人类锌指蛋白ZNF382对肌生成的调控作用.人类ZNF382基因在肌肉组织中高表达,ZNF382的mRNA水平在C2C12细胞的肌生成过程中上调,ZNF382调节肌肉特异性基因的表达,在NIH3T3细胞中,ZNF382与E-box蛋白E12和成肌调节因子MyoD共转增强肌肉肌酸激酶MCK启动子的活性;ZNF382的启动子预测分析也发现ZNF382的启动子上含有MyoD和血清反应因子SRF的结合位点,这些结果提示人类ZNF382蛋白在肌生成中起着重要的作用.