Shiva A 基因在转基因烟草中的表达及其对烟草青枯病菌(Pseudomonas solanacearum pv tabaci)的抗性

利用农杆菌介导的方法转化烟草外植体,通过抑菌圈实验和试管苗抗菌能力鉴定实验,表明表达采用植物偏爱密码子人工合成的抗菌肽Shva A基因的转基因烟草植株对烟草青枯病的抗病性上升。其中转基因植株Sc-4和Sc-6植株的R1代试管苗与对照植株相比较,它们的病情指数分别下降了42.1%和60.6%。     

川草2号老芒麦（Elymus sibiricus L.）UV-B辐射敏感基因rbcL的克隆及其调控表达研究

rbcL是编码光合关键酶1,5-二磷酸核酮糖羧化酶（Rubisco）大亚基的基因。本文运用mRNA差异显示技术（DDRT-PCR）并通过5ˊRACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) 从高原植物川草2号老芒麦（Elymus sibiricus L. cv. 'chuancao No.2'）中获得了受增强UV-B辐射抑制的rbcL基因,该基因全长cDNA为1.51kb,开放阅读框（ORF）长1.434kb,编码477个氨基酸。氨基酸序列与Elymus trachycaulus中的Rubisco大亚基具有97％的同源性、与Triticum aestivum和Hordeum comosum的Rubisco大亚基同源性均为 98％。Northern杂交分析表明,增强UV-B辐射后6h,rbcL基因表达受到强烈抑制,处理后60h,其表达几乎完全被抑制,表明即使是长期生长在高原地区、强UV-B辐射条件下的高原物种,在受到较强的UV-B辐射后,其rbcL基因的转录也会受到抑制。     

转基因烟草表达西红花CSzCD基因产生西红花酸

为研究转基因烟草中产生西红花酸的可行性,在本研究中,西红花玉米黄素裂解酶（CSzCD）基因插入到pBI121载体的花椰菜花病毒（CaMV）35S启动子下游,通过农杆菌介导整合到烟草基因组中。通过Southern blotting 分析得到21株转基因烟草植株系; 转基因烟草叶片提取物Western blotting 和HPLC分析显示有西红花酸的产生,然而阴性对照中并没有发现西红花酸的存在。     

麻疯树两种核糖体失活蛋白的表达模式分析

目前,麻疯树核糖体失活蛋白已发现2种:种子中的毒蛋白curcun和叶片中的逆境诱导蛋白curcin-L,其基因的表达模式均呈现出器官特异性.mRNA和蛋白质水平分析显示,curcin只在种子的胚乳中积累,且表达开始于心型胚时期,成熟时达到最高;而curcin-L在正常生理条件下并不表达,但受脱落酸、水杨酸、干旱,高低温等胁迫诱导时仅在叶片中表达.     

水稻精细胞差异表达基因RSG6的克隆和初步研究

用水稻 (Oryza sativa L.)精细胞优势表达克隆BF475207为探针,筛选水稻精细胞cDNA文库,得到一全长为1 176 bp的序列,其开放读码框编码281个氨基酸,与已知蛋白质无明显同源性,属于一新发现的基因,GenBank登录号为AF442490.Southern杂交显示该基因可能含有内含子.RT-PCR结果显示该基因在根、叶、二细胞花粉、成熟花粉、授粉子房和精细胞中均有表达,但在精细胞中的表达量要高得多,是精细胞差异表达基因.将此基因命名为RSG6 (rice sperm gene 6).将RSG6的编码区克隆到表达载体pQE30上,构建重组质粒.在大肠杆菌M15中表达出N端融合了6×His的融合蛋白.用纯化的融合蛋白免疫家兔,制得高效价、高特异性的抗体.     

多重PCR快速确证外源基因在转基因小麦后代的传递

根据转入小麦0世代中的高分子谷蛋白亚基1Dx5基因和报告基因uidA、作为选择标记的除草剂抗性基因bar的序列,设计合成三对引物。以整合uidA+bar的质粒pAHC25和整合1Dx5的质粒p1Dx5为模板寻找uidA与1Dx5及或bar多重扩增的最佳模板浓度及最适退火温度。MPCR模板量是单对引物扩增时的两倍,引物浓度同常规PCR为0.3μM,uidA与bar的适宜退火温度范围为57.1 - 62.3℃;uidA与1Dx5为60.0℃-60.6℃;uidA、bar、1Dx5的最适合退火温度范围为57.0℃-58.4℃。MPCR对大小相差50bp及以下的多重扩增片段可通过10%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。在此基础上对14株T1代转基因小麦基因组DNA进行多重PCR扩增,筛选出基因未分离的小麦后代,并与常规PCR比较,结果一致,其中11株同时传递1Dx5和bar基因、1株同时传递uidA、bar和1Dx5基因,3株未检测到外源基因。表明MPCR在快速确证外源基因在转基因植株后代的传递中作用显著。研究在常规PCR反应体系上,对模板浓度和多重引物退火温度进行微调,且把MPCR技术与PAGE技术结合起来,提高了研究结果的准确性,获得了较好的扩增和检测效果,简化了MPCR优化程序,使MPCR的优势更明显,为该技术的广泛应用提供了借鉴。     

麻疯树核糖体失活蛋白Curcin2的原核可溶性表达及其抗真菌活性研究

Curcin2是麻疯树幼苗在真菌侵染、干旱及高低温胁迫下诱导产生的一种核糖体失活蛋白.采用分子克隆的方法,从麻疯树基因组中扩增到Curcin2成熟肽编码基因,分别连接到质粒载体pGEX-6p-1、pMAL-c5E上,转化大肠杆菌最终获得重组菌PGC(pGEX-6p-1-curcin2)和PMC(pMAL-c5E-curcin2).在不同温度、IPTG浓度、时间诱导下,Curcin2在重组菌PGC中均以包涵体形式表达,在重组菌PMC中主要以可溶性融合蛋白形式表达,且蛋白质的表达量与诱导条件相关.重组菌PMC表达可溶性curcin2的优化条件为:温度28℃,IPTG 0.3mmol/L,时间8h,此条件下目的蛋白占总蛋白表达量的30.6％,1L培养物中可获得19.74mg电泳纯的重组蛋白.重组蛋白可被MBP TrapTM HP柱亲和纯化并与curcin抗体发生抗原抗体反应.体外抗真菌活性实验表明,纯化后的curcin2融合蛋白有抑制真菌生长作用,且对小麦赤霉、油菜菌核的抑制作用强于curcin.此蛋白的获得为其相关功能的研究奠定了基础.     

麻疯树叶中过氧化物酶JCP-1的分离纯化和几种特性的检测

麻疯树叶片蛋白粗提液经硫酸铵分级沉淀,强阴离子琼脂糖、强阳离子琼脂糖和交联葡聚糖层析,得到一个比活为4499U·mg-1（蛋白）过氧化物酶,命名为JCP-1。其分子量为49kDa,等电点为pH3.3,最适pH为5.0-6.0。以H2O2为底物的Km为2.14mmol·L-1。JCP-1具有宽泛的最适保存pH（7.0-11.0）和较高的耐热性（80℃高温处理15min,活性保持在90%以上）。30%PEG6000处理模拟干旱胁迫及50℃高温胁迫麻疯树苗,其叶片中JCP-1活性分别提高121%和155%。     

麻疯树中ADP核糖基化因子基因的克隆和表达

从麻疯树cDNA文库中筛选到包含完整编码序列的ADP核糖基化因子的cDNA序列,命名为Jc-arf．其长度为887bp,开放阅读框546bp,推测的编码蛋白含181个氨基酸残基,具有典型的GTP结合蛋白家族的特点：P框（GLDAAGKT）、G’框（DVGGQ）和G框（NKQDL）。序列分析显示,Jc-arf矿接近于人类ClassI型arf基因,其蛋白序列与多种植物ARF有很高的同源性。半定量RT-PCR结果显示,Jc-arf的表达具有一定的组织特异性,在花中最丰富。PEG、低温、NaCl胁迫下,Jc-arf的表达受PEG和低温的诱导,而对NaCl胁迫不敏感。