拉美斑潜蝇生活史观察

拉美斑潜蝇是云南省新发现的一种危害花卉、蔬菜作物的害虫。经１９９６～１９９７年度在昆明地区塑料大棚内观察,该虫１年在满天星上可完成１１代,世代重叠。完成１代的历期,最短需要１９天,最长需７２～７８天。     

一种新型的CRISPR/Cas9-hLacI双链DNA供体适配基因编辑系统

在CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑中,借助于双链DNA （double-stranded DNA,dsDNA）供体模板的重组效应能够实现对目标基因组靶位点的精确编辑和基因敲入,然而高等真核生物细胞中同源重组的低效性限制了该基因编辑策略的发展和应用。为提高CRISPR/Cas9系统介导dsDNA供体模板的同源重组效率,本研究利用大肠杆菌（Escherichia coli）乳糖操纵子阻遏蛋白LacI与操纵序列LacO特异性结合的特点,通过重组DNA技术将密码子人源化优化的阻遏蛋白基因LacI分别与脓链球菌（Streptococcus pyogenes）源的SpCas9和路邓葡萄球菌（Staphylococcus lugdunensis）源的SlugCas9-HF融合表达,通过PCR将操纵序列LacO与dsDNA供体嵌合,构建了新型的CRISPR/Cas9-hLacI供体适配系统（donor adapting system,DAS）。首先在报告载体水平上对Cas9核酸酶活性、DAS介导的同源引导修复（homology-directed repair,HDR）效率进行了验证和优化,其次在基因组水平对其介导的基因精确编辑进行了检测,并最终利用CRISPR/SlugCas9-hLacI DAS在HEK293T细胞中实现了VEGFA位点的精确编辑,效率高达30.5%,显著高于野生型。综上所述,本研究开发了新型的CRISPR/Cas9-hLacI供体适配基因编辑系统,丰富了CRISPR/Cas9基因编辑技术种类,为以后的基因编辑及分子设计育种研究提供了新的工具。     

西双版纳片断季节性雨林蚂蚁物种多样性研究

以西双版纳勐仑自然保护区为对照,采用陷井诱捕法和亲方调查法比较研究了３个不同面积、不同环境状况和片断季节性雨林蚂蚁的群落组成及物种多样性变化。结果表明：所获蚂蚁隶属４亚科２４属５０种,以城子龙山物种数量多。各样地优势种均不相同。４类样地间的共有物种较少,只有４种;相似性较低,相似性系 ０．１６２２～０．３５４８。聚类结果显示,植物园保护区与城子龙山最先聚为一类,然后与自然保护区聚为一类,最后才与曼     

基于SSA修复机制和特异性核酸酶活性检测的双荧光报告载体系统的开发及应用

报告载体系统因构建快捷、改造简单、操作容易、经济有效,并且能通过介导筛选核酸酶阳性细胞富集基因组修饰的阳性细胞克隆,而成为特异性核酸酶活性检测的重要手段。基于非同源末端连接(Non-homologous end joining,NHEJ)修复机制的报告系统在引入DNA双链断裂(Double strand breaks,DSBs)后,经过优化最高也只有2/3的概率实现报告基因的修复;而单链退火(Single strand annealing,SSA)修复机制在引入DSBs后,理论上可以实现报告基因100%的修复,具有更高的灵敏度,有利于活性较低的特异性核酸酶活性的检测,为基因组修饰研究中特异性核酸酶活性的检测提供了有效的手段。本研究设计并构建了3套基于SSA修复机制的双荧光报告载体系统,并应用mRFP-eGFP系统检测了3对ZFNs的有效活性,其活性检测结果分别为8.9%、9.3%和5.0%,该研究为核酸酶活性的检测提供了有效的手段。     

云南六种实蝇的RAPD快速鉴定

采用RAPD技术构建了果实蝇属（Bactrocera）的南瓜实蝇(B. tau)、黑漆实蝇(B.scutellaris)、具条实蝇(B. scutellata)、瓜实蝇(B. cucurbitae)、桔小实蝇(B. dorsalis)和番石榴实蝇(B. correcta)6种实蝇的指纹图谱.从131个引物中筛选出5个重复性好、多态性高的引物,共扩增出302条谱带,其中111条谱带具有遗传多态性.引物OPC-01、OPI-17、OPL-07、OPL-08以及OPL-16可以用于6种实蝇的分类鉴定.     

伊大头蚁蚁巢的结构与分布

伊大头蚁Pheidole yeensis是舞草Codariocalyx motorius种子的主要搬运者, 在舞草的扩散中起着重要作用。2000年在西双版纳和思茅地区景谷县对伊大头蚁种群数量、蚁巢结构与分布进行了调查。结果表明:伊大头蚁主要在土壤中筑巢,深度可达地下50 cm;每巢蚁量一般在2 000～3 000头,最多的可达万头;伊大头蚁大多在海拔1 000～1 200 m的山腰筑巢, 以西坡的蚁巢密度最大,南坡次之,北坡最少;在丢荒2～3年的地里筑巢最多,其次为玉米和花生地,在森林里筑巢的相对较少;伊大头蚁的蚁巢呈均匀分布,但巢群间相互排斥。伊大头蚁筑巢生境与舞草生长的环境基本一致,蚁巢结构与蚁量有利于舞草的扩散与建群。     

基于mtDNA Cytb 的六种果实蝇的分子鉴定

本研究首次对果实蝇属的桔小实蝇Bactrocera dorsalis、瓜实蝇B. cucurbitae、南瓜实蝇B. tau、番石榴实蝇B. correcta、具条实蝇B. scutellata、黑漆实蝇B. scutellaris等6种实蝇mtDNA Cytb基因进行了测序。对这6种实蝇72个个体mtDNA Cytb基因中段420 bp的碱基序列进行分析,得到38种单倍型,发现了116个变异位点,其中30个位点较为稳定。对这6种实蝇与其各自鉴别位点的对应关系研究表明,mtDNA Cytb基因可以作为这6种实蝇种类鉴别的分子标记。     

一种新型提高HDR效率的CRISPR/Cas9-Gal4BD供体适配基因编辑系统

近年来，CRISPR基因编辑及衍生技术迅速发展，在生命科学、生物医学研究以及动植物育种领域得到了广泛应用。基于DNA双链断裂(double-stranded break, DSB)同源指导修复(homology-directed repair, HDR)机制的基因敲入和点编辑是基因编辑的重要策略，但效率偏低亟待提高。本文提出了驱动供体DNA富集至DSB处以提高HDR效率的新策略，并设计了一套CRISPR/Cas9-Gal4BD供体适配基因编辑系统(donoradapting system, DAS)。该系统主要利用Gal4 DNA结合域(Gal4 binding domain, Gal4BD)作为配体蛋白与Cas9融合表达，将Gal4BD结合序列(Gal4 binding sequence, Gal4BS)作为受体序列与双链DNA (double-stranded DNA, dsDNA)供体结合，以期提高HDR效率。使用HEK293T-HDR.GFP报告细胞系的初步研究结果表明当dsDNA供体同源臂在一定长度(100～60 bp)时该系统能够提高HDR效率2～4倍。进一步的优化研究表明...