猪1型圆环病毒全基因组克隆及其感染性初步鉴定

猪圆环病毒(porcine circovirus,PCV)是由Tis-cher等[1]于1974年在PK-15细胞中发现,当时认为是一种细胞污染物,后被证实为一种新的病毒。病毒粒子为20面体对称,无囊膜,以滚环方式进行复制,可在PK-15细胞上生长但不引起细胞病变。其基因组是一种环状、单股副链DNA,与鸡贫血病毒(chicken anemia virus,CAV)、鹦鹉喙羽病毒(psittacine beak and feather disease circovirus,PBF-DAV)和人的TT病毒(transfusion transmittedvirus,TTV)同属圆环病毒科。猪圆环病毒有两种基因型即:PCV1和PCV2。前者广泛存在于猪源肾细胞中,在猪的组织…     

表达O型口蹄疫病毒保护性抗原表位重组PRRSV的构建及其鉴定

以高致病性猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗的感染性分子克隆(rHuN4-F112)作为载体,将O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1基因的421~480nt(141~160aa)和598~639nt(200~213aa)两优势保护性抗原表位串联成的目的基因,通过突变PCR的方法插入Nsp2中的508~532位缺失区域,经体外转录后转染至BHK-21细胞中培养36 h,将上清接种至MARC-145细胞中培养,并在MARC-145细胞中连续传代,拯救重组病毒。经RT-PCR扩增,MluⅠ酶切及测序验证,结果表明插入的外源基因及人为突变的MluⅠ分子标记都正确,说明重组病毒拯救成功,且该重组病毒能够在MARC-145细胞中稳定传代,将此重组病毒命名为rPRRSV-F112-O/VP1ep。rPRRSV-F112-O/VP1ep能够在MARC-145细胞上引起明显的细胞病变,间接免疫荧光检测表明外源基因在该病毒中成功获得了表达。经过生物学特性分析,该病毒的TCID50=-log10-6.75/0.1 mL,且在MARC-145细胞中整体生长速度与其亲本病毒rHuN4-F112(△508-532)相似,但明显高于rHuN4-F112病毒。     

口蹄疫病毒单克隆抗体的制备及检测应用

用纯化的口蹄疫病毒(Footandmouthdiseasevirus,FMDV)免疫BALB/C小鼠,将免疫鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,采用有限稀释法进行克隆,经筛选获得多株能稳定分泌抗FMDV单抗的杂交瘤细胞株。选择其中一株(2G12)用于下列实验,其细胞培养上清液的效价是1:256,腹水效价是1:1280;以自行制备的兔抗FMDV高免血清IgG为捕获抗体包被酶联免疫吸附试验微量反应板,以单抗2G12为第二抗体,建立了快速检测FMDV抗原的双抗体夹心ELISA,该方法能检出90ng病毒,而且只与FMDV发生特异性反应,与猪瘟病毒(HCV)、猪蓝耳病病毒(PRRSV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和乙脑病毒(JEV)均不发生反应。本研究为检测口蹄疫病毒抗原提供了灵敏和特异的方法。     

表达ApxIA的血清7型胸膜肺炎放线杆菌弱毒菌株的构建及特性分析

猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌引起的一种高度接触传染疾病,严重阻碍着全球养猪业的发展,疫苗接种是控制该病的有效措施。为提高胸膜肺炎放线杆菌弱毒疫苗的免疫效力,以及探索胸膜肺炎放线杆菌弱毒疫苗作为呼吸系统病原疫苗载体的可行性,通过穿梭质粒pJFF224-XN将完整的apxIA基因导入apxIIC基因缺失突变株HB04C-中,构建了含有apxIA和apxIIA基因的弱毒疫苗菌株HB04C2(apxIIC-/apxIIA+/apxIA+)。通过对HB04C2的生物学特性分析发现,穿梭质粒可稳定传代,并表达ApxIA,其生长特性未受穿梭质粒的影响。将HB04C2以气管接种方式免疫仔猪,可产生针对ApxIA和ApxIIA的抗体。二免后2周以高致病性的血清1型胸膜肺炎放线杆菌攻毒,该弱毒疫苗可提供良好的免疫保护效果。     

共表达猪繁殖与呼吸综合征病毒修饰型GP5和M蛋白增强DNA疫苗免疫应答的研究

为了增强猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)DNA疫苗免疫效力,分别以PRRSV ORF5m(修饰型ORF5基因)及ORF6为候选基因,构建了单基因或双基因共表达的真核表达质粒pCI-ORF5m、pCI-ORF6及pCI-ORF5m/ORF6。转染BHK-21细胞,Western blot检测证实ORF5m和ORF6基因均获得正确表达,并且共表达的GP5m和M蛋白能够形成异源二聚体。将构建的表达质粒免疫小鼠,首免后6周共表达ORF5m和ORF6基因的pCI-ORF5m/ORF6免疫组小鼠血清中和抗体全部阳转,8周时最高可达到1:32,同时还可检测到较高的特异性细胞免疫应答,明显高于单独表达ORF5m基因的pCI-ORF5m免疫组。进一步将DNA疫苗免疫断奶仔猪,pCI-ORF5m/ORF6免疫组同样能诱发优于pCI-ORF5m免疫组的中和抗体和细胞免疫反应。上述研究结果表明采用ORF5m和ORF6双基因共表达策略能够显著提高PRRSV DNA疫苗效力,为PRRSV新型疫苗的研制提供了有用的数据。     

携带猪γ干扰素基因逆转录病毒载体的构建及其在猪肾细胞(PK-15)中的表达

将梅山猪γ干扰素基因定向插入逆转录病毒载体pLXSN(neor),构建逆转录病毒重组质粒,利用脂质体介导法将重组质粒转染逆转录病毒包装细胞系PA317,转染细胞经含G418(400μg/mL)培养基筛选一周后获得稳定产毒的PA317细胞系。从细胞培养上清中提取RNA,进行RT-PCR检测,扩增到目的片段;将上清感染猪肾细胞(PK-15),经含G418(400μg/mL、600μg/mL和800μg/mL)的DMEM筛选一周,间接免疫荧光表明表达的猪γ干扰素主要锚定于细胞膜。收取PK-15细胞上清,在牛肾细胞(MDBK)上进行干扰素抗病毒活性检测,结果显示重组病毒表达的猪γ干扰素抗水泡性口炎病毒(VSV)的活性为1200IU/106cells.48h。以表达的干扰素处理PK-15细胞后,经细胞病变抑制法测定,重组猪γ干扰素可以抵抗口蹄疫病毒(FMDV)感染。试验结果表明猪γ干扰素基因已成功插入逆转录病毒基因组并在PK-15细胞中表达,表达的重组猪γ干扰素具有较强的抗病毒生物活性。     

大肠杆菌Ee株SLT-ⅡeB基因的3拷贝融合表达及其生物学活性与免疫原性

根据大肠杆菌Ee株主要免疫原性片段SLT-ⅡeB的基因序列,设计合成两对引物,利用谷胱甘肽-S-转移酶(GST)表达系统将三拷贝SLT-ⅡeB的融合基因串联于GST下游,并在大肠杆菌中成功表达,获得了大小约为45kDa融合蛋白GST-3B,表达产物以包涵体形式产生,Western blot检测证实表达的融合蛋白具有良好的生物学活性;结合抑制试验表明,与单拷贝融合表达蛋白GST-B相比,GST-3B与水肿毒素受体的亲和力更强。GST-3B及GST-B与等量弗氏不完全佐剂乳化后制成亚单位疫苗,间隔两周两次皮下免疫小鼠。结果GST-3B疫苗组产生的抗体水平明显高于GST-B疫苗组,但两种疫苗组的抗体消长趋势相同。二免后两周用5×LD50的Ee株大肠杆菌进行腹腔攻毒。GST-3B疫苗组保护率为60.0%(6/10),明显优于GST-B疫苗组40.0%(4/10)。研究结果表明GST-3B具有良好的生物学活性和免疫原性,可以作为疫苗添加成分,显示了良好的应用前景。     

猪瘟弱毒C81株全基因组测序及分子结构预测

参照已发表的猪瘟病毒弱毒株的序列,设计7对覆盖全长基因组的引物,通过RT-PCR从感染猪瘟病毒弱毒株的PK-15细胞中扩增得到7个cDNA片段,分别克隆到pMD18-T载体并测序,利用DNASIS软件获得猪瘟病毒C81株全基因组序列(GenBankAY663656).C81株基因组全长12310nt,只有一个大的开放阅读框,编码3898个氨基酸的聚蛋白.序列分析表明,C81株开放阅读框与其它各毒株核苷酸和氨基酸序列的同源性变化较大,分别为84.4%～99.6%和91.6%～99.4%.同时,我们绘制了26株CSFV ORF的进化树,比较了CSFV 5'非翻译区核苷酸序列并推测其二级结构,发现不同毒株之间存在较大的差异,另外对C81株聚蛋白的功能域和三维结构进行了预测.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒cDNA文库的构建及基因组序列的测定

猪繁殖与呼吸综合征自1987年首次在美国发现以来[1],几年之内便席卷了北美洲和欧洲大陆[2],后蔓延至许多亚太国家和地区 [3,4].我国1995年首次暴发此病,该病在我国普遍存在,给我国养猪业的健康发展造成巨大障碍[5].目前国内外尚无理想防疫疫苗.当前用于预防的猪繁殖与呼吸综合征的主要疫苗是弱毒苗和灭活疫苗.灭活疫苗免疫效果差,弱毒苗能提供较好的免疫保护,但毒力返强的几率相当高,这一点已在几年前丹麦等国因广泛使用弱毒苗而导致该病大暴发中得以证实[6].     

猪源支气管败血波氏杆菌百日咳杆菌黏附素基因的原核表达及其抗体检测ELISA方法

[目的]以猪源支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)百日咳杆菌黏附素(PRN)基因的原核表达产物为抗原建立检测PRN抗体的间接ELISA方法.[方法和结果]利用谷胱甘肽-S-转移酶(GST)表达系统对PRN基因在大肠杆菌中进行融合表达.SDS-PAGE和Western blot检测证实该基因获得高效表达,产物易于纯化且具有良好的免疫学活性.通过凝血酶酶切GST-PRN并回收,获得不含GST载体蛋白的PRN蛋白片段.以PRN蛋白片段为抗原建立检测天然PRN抗体的间接ELISA方法.该方法对猪巴氏杆菌病等7种常见细菌性疾病阳性血清的检测结果均为阴性,其敏感性比乳胶凝集试验提高4～128倍,能检测到人工感染14 d后的仔猪血清抗体IgG,对临床送检的1,229份猪血清的检测阳性率为32.7%.ELISA方法对阳性猪场的监测结果预示了保育期仔猪的合群导致猪群大量感染支气管败血波氏杆菌.[结论]该方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点,可用于猪群PRN抗体水平监测和猪波氏菌病流行病学调查.