V型分泌系统(T5SS)在禽致病性大肠杆菌中的分布及流行情况

【背景】禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)可引起禽的大肠杆菌病,严重危害养禽业。V型分泌系统(Type V secretion system,T5SS)在APEC感染过程中发挥重要作用。【目的】分析不同致病型大肠杆菌的T5SS在APEC中的分布规律,探讨T5SS与APEC的大肠杆菌进化分群及其他毒力因子的关联性。【方法】根据大肠杆菌的15个T5SS序列设计特异性引物,采用PCR检测T5SS在APEC临床分离株中的分布;分析APEC菌株的系统进化分群及毒力因子分布,探讨T5SS分布和APEC系统进化分群及毒力因子的相关性。【结果】T5SS在APEC临床分离株中广泛分布,其中ydeK和pplfP的分布率最高,分别为98.55%和92.03%;而upaC和pic的分布率均低于10%。系统进化分群结果显示,APEC主要属于A、B1和D进化分群,B2群较少;T5SS分布和进化分群分析发现ehaA、ehaB、pic、vat在D进化分群APEC菌株中分布率较高,而ehaG、ag43/flu、apaC主要分布于A及B1群APEC中。然而,T5SS和APEC其他毒力基因分布无明显的关联性。【结论】T5SS广泛存在于APEC分离株中,且部分T5SS分布与大肠杆菌系统进化分群存在关联性。     

滑液支原体NADH氧化酶的酶学活性及亚细胞定位研究

【背景】许多研究表明,支原体的NADH氧化酶(NADH oxidase,NOX)不仅在胞浆中发挥生物酶学功能,也存在于细胞膜上发挥黏附宿主细胞功能。【目的】对滑液支原体(Mycoplasma synoviae,MS)的NOX进行酶学活性及亚细胞定位研究,分析其在MS致病过程中的潜在作用。【方法】对MS的NOX蛋白进行原核表达、纯化,然后对重组MSNOX (rMSNOX)的酶学活性及影响酶活的条件进行研究,测定其酶比活力、米氏常数及最大反应速率,接着用MS阳性血清及制备的rMSNOX兔多克隆抗体,分别与rMSNOX蛋白及MS全菌、膜蛋白和胞浆蛋白进行Western blotting反应,鉴定rMSNOX的免疫原性及其在MS中的分布情况。【结果】在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达rMSNOX蛋白,相对分子质量约为53 kD,并获得纯化的rMSNOX蛋白;酶活测定显示rMSNOX蛋白的酶比活力为14.17IU/mg,最适酶促温度为37℃,最适pH为7.5,双倒数法求得rMSNOX的最大反应速率V_max为21.8μmol/(L·min),米氏常数K_m     

滑液支原体醛缩酶的亚细胞定位及免疫原性

【背景】滑液支原体(Mycoplasma synoviae,MS)感染能够引起鸡和火鸡的气囊炎、关节渗出性的滑液囊膜及腱鞘滑膜炎等。有研究表明,许多支原体中与代谢相关的酶类不仅分布在细胞质,也分布于细胞膜表面,通过结合宿主细胞的胞外基质蛋白,协助病原菌黏附入侵宿主细胞。已有报道牛支原体(Mycoplasma bovis)和鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum)的醛缩酶(Fructose-bisphosphate aldolase,FBA)分布在膜蛋白和胞浆蛋白中,而MS的FBA蛋白还未见相关研究。【目的】对MSFBA蛋白进行生物信息学分析、原核表达、免疫原性分析及亚细胞定位检测,为进一步探索MS代谢相关酶类的生物学功能奠定基础。【方法】通过分析软件PSORTb、SignalP 4.1 Server和TMHMM Server在线预测MSFBA的亚细胞定位、信号肽及跨膜区,并用BLASTn和MEGA 5.0进行同源比对及进化树分析;通过Overlap PCR点突变扩增MS的fba全基因序列,连接表达载体pET-28a(+)并进行原核表达及纯化,获得纯化后的重组MSFBA(rMSFBA)蛋白;用MS阳性血清进行Westernblot鉴定rMSFBA的免疫原性;用纯化的rMSFBA蛋白制备兔多克隆抗体,与MS全菌蛋白、膜蛋白及胞浆蛋白进行Western blot分析,同时对MS全菌进行悬浮免疫荧光分析,检测MSFBA的膜定位情况。【结果】生物信息分析预测MSFBA分布在细胞质中,无信号肽,无跨膜区,在MS种内相似性高达99%,与其他种属FBA相似性在61%-78%之间,进化树显示其与牛鼻支原体(Mycoplasma bovirhinis)、仓鼠支原体(Mycoplasm acricetuli)等的FBA蛋白进化关系较近,与精氨酸支原体(Mycoplasma arginini)、人型支原体(Mycoplasma hominis)等的FBA蛋白进化关系较远;表达rMSFBA蛋白并纯化,经测定其相对分子质量大小约为33kD;rMSFBA能与MS阳性鸡血清特异性结合,证实其具有较好的免疫原性;Western blot显示抗rMSFBA的兔血清能与MS全菌蛋白和胞浆蛋白反应,而与膜蛋白不反应,说明MSFBA蛋白分布于胞浆中;悬浮免疫荧光实验证实MS的细胞膜上未见FBA蛋白分布。【结论】首次报道了滑液支原体的FBA蛋白是一个高度保守的免疫原性蛋白,主要分布在细胞质中,该结果为进一步研究MSFBA蛋白的生物学功能提供了分子基础。     

禽致病性大肠杆菌脂多糖核心型分布与毒力基因的相关性分析

【目的】大肠杆菌脂多糖(LPS)核心型根据其化学结构的不同分为5种,即R1、R2、R3、R4和K12。通过对禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)安徽、江苏、上海和河南等省市分离株的脂多糖核心型分布情况的研究,分析其与大肠杆菌主要毒力基因之间的潜在联系,以期为APEC的研究和防治提供参考。【方法】对分离到的76株APEC,利用PCR方法开展对LPS核心型分型鉴定和毒力基因检测;分析LPS核心型的分布和毒力基因、致病性之间的相关性。【结果】在76株APEC分离株中,68.4% (52株)为R1核心型,15.8% (12株)为R3型,11.8% (9株)为R4型,3.9% (3株)为R2型,未检测到K12核心型。毒力基因鉴定结果中yijp、mat、fimC、ibeB和ompA的检验阳性率均达到90%以上,可作为APEC的保守基因。其中LPS核心型R1与neuC、cva/cvi、irp2均具有显著正相关性(P<0.05),R3与iroN、irp2均具有显著负相关性(P<0.05),R4核心型与aatA显著正相关(P<0.05)。【结论】APEC的LPS核心型主要为R1。LPS核心型对部分毒力基因分布具有显著影响。     

鼠伤寒沙门菌rtsB基因缺失株的构建及其生物学特性

【背景】鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)是一种重要的人畜共患病原菌,严重危害养殖业及人类健康。调控蛋白在病原菌的生存及感染过程中发挥重要作用。【目的】构建鼠伤寒沙门菌调控基因rtsB缺失株和互补株,分析调控蛋白RstB对鼠伤寒沙门菌生物学特性和致病性的影响。【方法】利用Red同源重组的方法构建鼠伤寒沙门菌SAT52的rtsB基因缺失株,并利用互补质粒构建互补株。然后比较分析野生株SAT52、缺失株?rtsB和互补株C?rtsB的生长特性、运动性、生物被膜形成能力、黏附入侵能力、胞内存活能力及致病性的差异。【结果】缺失rtsB基因不影响SAT52的生长速度,但导致运动能力增强,生物被膜形成能力减弱。细胞感染试验结果表明,rtsB基因有助于鼠伤寒沙门菌对Hela细胞的黏附入侵及RAW264.7细胞内的存活。动物试验结果表明rtsB基因缺失显著降低鼠伤寒沙门菌的致病力。【结论】rtsB基因在鼠伤寒沙门菌感染过程中发挥重要作用,可为阐释鼠伤寒沙门菌的致病机制提供参考。