噬菌体介导的毒力基因的转移

随着分子细菌学研究的不断深入,越来越多的焦点集中在病原菌的毒力因子上,包括细菌的毒素、粘附素、侵袭素、毒力岛等,目的为预防细菌性疾病寻求可靠的诊断方法和防疫措施,并从基因水平提示致病的本质。从多研究表明细菌的毒力因子与噬菌体的转换有关。噬菌体作为一个附属的遗传因素,在基因传播、细菌种群的遗传多样性方面起了重要的作     

细菌CRISPR-Cas 系统功能及其与噬菌体相互作用

摘要:近来研究发现,细菌CRISPR-Cas 系统在宿主菌抵抗可移动基因元件(mobile genetic elements,MGEs)的过程中发挥重要作用。CRISPR-Cas还参与宿主菌群体行为和毒力基因调控、DNA修复和基因组进化过程。本文着重综述细菌CRISPR-Cas系统的结构、类型、作用机制及其适应性免疫之外的其他功能(如对内源性基因表达的调控、促进基因组进化、DNA修复等);概述噬菌体抵抗CRISPR-Cas系统的机制,并对噬菌体-宿主菌相互作用进行探讨和展望。     

8株动物源编码Stx2短尾噬菌体的生物学特性

[目的]对8株源自大肠杆菌O157编码Stx2毒素的噬菌体生物学特性进行研究.[方法]丝裂霉素C诱导8株大肠杆菌O157菌株释放噬菌体,采用PCR作初步鉴定,分离、纯化噬菌体基因组,随机引物法地高辛(DIG)标记stx2基因片段作为探针,对纯化的噬菌体采用Southernblot进行Stx2噬菌体再次鉴定,透射电子显微镜观察纯化的8株Stx2噬菌体的形态特征,通过限制性内切酶图谱分析,确定噬菌体的核酸类型和基因组大小、以及限制性内切酶酶切片段多态性,并分析噬菌体的蛋白质组成特征.[结果]Southern blot证实分离的8株噬菌体为Stx2噬菌体,电镜下观察的各株Stx2噬菌体形态一致,头部均为正六边形,尾部很短,属于短尾噬菌体科,各株噬菌体之间存在相同的蛋白结构模式,基因组为双链DNA,限制性内切酶片段长度表现出一定的多态性,噬菌体的基因组大小从48.0-65.3 kb不等.[结论]来源不同菌株的8株编码Stx2噬菌体均为短尾噬菌体,其蛋白结构模式一致,但基因组具有不同组成.     

VT2-B亚单位的重组表达及单克隆抗体的制备

以大肠杆菌O157DNA为模板扩增VT2-B亚单位,纯化后经EcoRⅠ和XhoⅠ酶切,连入表达载体pGEX4T-2,构建重组表达质粒pGEX4T-2-VT2-B。转化到大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导,实现了VT2-B-GST融合蛋白的可溶性表达,表达量约占菌体总蛋白的35%。重组蛋白纯化后,免疫BALB/C小鼠制备单克隆抗体,得到2株融合细胞,制备了腹水单抗,测得单抗的ELISA效价为104。Western blot表明,该单抗能与重组蛋白特异性的结合。特异性单抗的获得为VT2毒素检测方法的建立奠定了基础。     

大肠杆菌O157噬菌体中vt2基因A、B亚单位的克隆与序列分析

根据GenBank中毒素基因vt1、vt2序列设计合成4对引物,以大肠杆菌O157菌株DNA为模板,扩增vt1、vt2,从只含有vt2的菌株中诱导释放噬菌体,以噬菌体DNA为模板进行PCR扩增,获得vt2、vt2-A、vt2-B 3条特异性DNA带;将vt2-A、vt2-B扩增产物纯化后,分别插入pMD18-T载体,测序结果与相应序列比较,vt2-A和vt2-B亚单位的基因序列与GenBank中编码VT2毒素的A、B亚单位的核苷酸序列(X07865,NC_002655,BA000007,AF291819)的同源性分别为98%～99%、96%～100%,确定vt2位于噬菌体,并为进一步研究大肠杆菌O157中VT噬菌体的毒力转导、VT2毒素的表达和应用奠定基础.     

大肠杆菌O157:H7中编码vt2基因的噬菌体的分离与鉴定

根据GenBank中VT1、VT2毒素的基因序列设计合成2对引物,以大肠杆菌O157H7菌株DNA为模板,扩增vt1、vt2.诱导只扩增出vt2的菌株释放噬菌体,利用多种指示菌经双层琼脂平板法来分离纯化VT2噬菌体,观察噬菌斑的特征,提纯病毒粒子进行电镜观察,并对噬菌体中vt2基因检测、克隆和序列分析.结果显示VT2噬菌体感染MC1061在双层琼脂平板上形成的噬菌斑小而混浊,多呈磨玻璃样;而首次感染大肠杆菌CC118(λpir),此后用MC1061分离的噬菌体,再以MC1061为指示菌,在双层琼脂平板上形成小而清晰透明的噬菌斑.电镜下噬菌体头部呈六边形外廓,尾部细长无尾鞘结构.以噬菌体DNA为模板进行PCR扩增,检测到vt2特异性DNA带,克隆的vt2基因序列与GenBank中编码VT2毒素的核苷酸序列(X07865,NC_002655,BA000007,AF291819)的同源性分别达到99%,确定编码VT2毒素的基因位于噬菌体上,并获得VT2噬菌体()HY.