利用超快时间分辨技术对光系统Ⅱ核心天线CP43和CP47的动力学荧光光谱的分析

采用超快时间分辨荧光光谱装置对光系统Ⅱ核心天线CP43和CP47进行了研究 ,并在 5 14.5nm激光激发下获得了它们的动力学荧光光谱。CP43和CP47的荧光光谱范围分别为 6 40～ 780nm和 6 30～ 775nm ,并且它们分别在约 6 80nm和 6 91nm处有最大峰 ,在这两个峰值处的荧光寿命分别约为 3.5 4ns和 3.2 2ns。通过理论计算认为在CP43和CP47中 ,叶绿素a的荧光发射效率分别约为 38.3%和 40 .6 %。讨论了类胡萝卜素到叶绿素a分子的能量传递 ,认为在CP43和CP47中 ,类胡萝卜素到叶绿素a分子的能量传递时间常数分别为 9.6× 10 11s-1和 1.3× 10 12s-1,能量传递效率分别为 47.5 %和 6 6 .5 % ,并且估计在这两种核心天线中 ,类胡萝卜素分子和叶绿素a分子的外周间距分别约为 0 .110nm和 0 .0 85nm。     

人松弛素原样蛋白H2在大肠杆菌中的表达、分离纯化及鉴定

利用聚合酶链式反应方法 ,从含有人前松弛素原cDNA基因的质粒 pMALp2X-hRLXH2上得到人松弛素原H2的编码基因 ,亚克隆到温度诱导型原核表达载体pBV2 2 0上 ,转化大肠杆菌DH5α细胞。经 4 2℃温度诱导 ,获得了目的基因的高效表达。目的蛋白质以包含体的形式存在于大肠杆菌细胞中。菌体经过超声波破碎 ,包含体裂解 ,蛋白质的体外变性还原 ,复性 ,SephadexG 75凝胶过滤层析 ,反相快速蛋白质液相层析等一系列分离纯化过程 ,得到了高纯度的重组Met 人松弛素原样蛋白H2 ,得率约为 2～ 3mg/L。对纯化的目的蛋白质进行了SDS PAGE电泳纯度分析 ,氨基酸组成分析 ,通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法测得目的蛋白质的分子量为 183 90 .4 (理论计算值为 183 92 .3 )。     

大豆对斜纹夜蛾幼虫抗性遗传的发展表达过程

采用植物数量性状遗传体系分离分析方法,通过4个感抗杂交组合研究了在网室人工接入斜纹夜蛾幼虫的条件下大豆抗斜纹夜蛾植株反应发育过程的遗传。不论P1、P2、F1、F2、F2：3多世代联合分析或单个分离世代分析,结果均表明大豆对斜纹夜蛾幼虫的抗性为两对主基因 多基因遗传模式。但在大豆生长发育的不同时期,随害虫数量的变化,其抗虫性遗传呈动态变化过程。在两对主基因充分表达日期,主基因的遗传率较高,达70.40%-99.21%,环境影响较小;多基因遗遗传率较低,为0.00%-22.29%。     

梨小食心虫化学感受蛋白cDNA的克隆、序列分析及原核表达

为了研究梨小食心虫Grapholita molesta化学感受蛋白（chemosensory proteins, CSPs）在化学感受系统中的作用, 本研究利用RT-PCR和RACE技术克隆到一条梨小食心虫化学感受蛋白的全长cDNA序列, 命名为GmolCSP （GenBank 登录号： JQ821389）。序列分析表明, GmolCSP开放阅读框序列为384 bp, 编码127个氨基酸残基, 预测N末端含有18个氨基酸组成的信号肽序列, 其成熟蛋白的预测分子量为12.80 kD, 等电点为8.33。该基因编码的氨基酸序列与其他鳞翅目昆虫化学感受蛋白的氨基酸序列具有较高同源性。RT-PCR结果显示, GmolCSP在梨小食心虫成虫触角、 去触角的头、 胸、 腹、 足和翅中都有表达。将GmolCSP重组到表达载体pET-32a中, 转入大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3）进行表达。SDS-PAGE和Western 印迹检测结果显示, 梨小食心虫化学感受蛋白基因在大肠杆菌中成功地表达出一个分子量约为29 kD的融合蛋白, 与预测的融合蛋白分子量大小一致。本研究结果为进一步研究该蛋白的分子结构和功能奠定了良好基础。     

葡萄糖异构酶突变体酶GIG138P和GIG138P-G247D在变铅青链霉菌中的高效表达及检测

将含有G138P单点突变和G138P-G247D双点突变的GI结构基因,分别克隆入E.coli链霉菌穿梭载体pHZ1272,成功构建了穿梭表达载体pHZGI1和pHZGI2。通过原生质体的转化,将穿梭表达载体导入变铅青链霉菌TK54菌株。30℃振荡培养24h,加入2 μg/mL 硫链丝菌素诱导表达12h。SDSPAGE电泳表明,两个穿梭载体在TK54菌株内表达出425 kD特异性条带。薄层扫描显示,突变体酶GIG138P和GIG138PG247D分别约占可溶性蛋白的19%和22%。Western杂交进一步证实GIG138P和GIG138PG247D在变铅青链霉菌TK54中获得了表达。     

人工合成的黑曲霉NRRL3135菌株植酸酶基因在毕赤酵母系统中的高效表达

本文以黑曲霉(Aspergillus niger)NRRL3135菌株植酸酶基因为对象,通过基因人工合成的方法去除了该基因的内含子与信号肽编码序列,换用在毕赤酵母(Pichia pastoris)中使用频率较高的密码子以优化其表达。该人工合成植酸酶基因(PhyA-as)以N端融合的方式正确插入到毕赤酵母表达载体pPICZαA。通过电击将重组表达载体整合入酵母染色体DNA中得到重组转化子。SDSPAGE结果与表达产物酶学性质研究表明植酸酶得到分泌表达,且与天然产物性质基本一致。筛选得若干株高产基因工程菌,其中SPANⅢ菌株达到了在摇床培养条件下,每毫升发酵液产生165000u植酸酶的水平,基本满足工业化生产的要求。     

抗菌肽VIP在毕赤酵母中的高效表达及鉴定

基于人抗菌肽VIP(Vasoactive intestinal peptide)基因序列,按照毕赤酵母密码子偏好性设计引物;用SOE-PCR法扩增目的基因;然后将目的基因克隆至毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA上,构建VIP分泌表达菌株GS115-p PICZαA-vip。用甲醇诱导96 h收集上清,用质谱进行鉴定,结果显示分泌表达产物与人抗菌肽VIP理论值(3 326.82 Da)完全一致,表明人抗菌肽VIP成功得到分泌表达。琼脂糖凝胶扩散法实验结果显示,重组VIP对大肠杆菌Escherichia coli ATCC25922和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus ATCC25923都有很强的抗菌活性,MIC(Minimal inhibitory concentration)分别为8 mmol/L和16 mmol/L。进一步细胞毒性和溶血性实验结果显示,重组VIP对正常细胞NCM460和IPEC-J2没有毒性,其对SD大鼠红细胞不具有溶血活性。通过透射电镜观察了VIP的抗菌机制,结果显示VIP主要通过破坏细胞膜的方式抑杀细菌。本研究为人抗菌肽VIP的开发应用和大量生产奠定了基础。     

超嗜热酯酶EST2在不同宿主中的异源高效表达研究

来源于超嗜热古菌Alicyclobacillus acidocaldarius的酯酶EST2是目前报道的活性最高的超嗜热酯酶,具有极大的工业应用价值。为促进EST2的生产应用,将其分别在大肠杆菌及毕赤酵母中进行异源表达,并就不同宿主对表达情况和重组酶酶学性质的影响进行了分析。在大肠杆菌和毕赤酵母中重组表达的EST2酶学性质基本一致:最适温度分别为75℃和77.5℃,最适pH均为8.0,比活力分别为4656.6 U/mg和4078.3 U/mg,70℃水浴保温4.5 h,残余活力均在70%以上。在摇瓶发酵的基础上,于5 L发酵罐中进行了重组大肠杆菌及毕赤酵母的高密度发酵。毕赤酵母高密度发酵120 h菌体干重达68 g/L,最大表达酶活力为959.6 U/ml。大肠杆菌高密度发酵25 h菌体干重达60.8 g/L,最大酶活力14825.6 U/ml,表达量是毕赤酵母的15.4倍,单位时间产量是酵母的74.2倍。结果表明大肠杆菌发酵周期短、表达量高,更适合进行嗜热酯酶EST2的高效生产,这为促进嗜热酯酶在工业生物技术产业的应用奠定了基础。     

蛋白质组表达谱

文章： M. Bantscheff et al., ＂Quantitative chemical proteomics reveals mechanisms of action of clinical ABL kinase inhibitors[定量化学蛋白质组学提示ABL激酶抑制剂的作用处理],＂Nat Biotech, 25：1035-44, 2007.（被67篇文章引用）