乳腺组织染色质免疫共沉淀方法的改进

作为研究基因表达调控的重要方法,近年来染色质免疫共沉淀（ChIP）得到了越来越广泛的应用,但有关将乳腺组织作为ChIP材料的研究及其方法尚未见报道。采用传统的组织ChIP试剂盒处理乳腺组织时,存在样品回收率低、乳脂/乳蛋白影响杂交效率和超声积热等问题,针对以上问题对乳腺组织ChIP方法进行改进。新方法省略组织均一化步骤、用酶切-超声法代替超声法进行染色质片段化、在细胞裂解和酶切步骤间增加洗涤步骤。结果显示,与脾脏组织相比,乳腺组织不适合进行组织均一化处理。酶切-超声法比超声法更适于对乳腺组织进行染色质片段化。采用改进后的ChIP方法获得的DNA样品中,靶序列得到显著的富集,所得的DNA样品能够满足测序（ChIP-Seq）要求。结果说明,改进后的方法适用于乳腺组织染色质免疫共沉淀,并为研究乳腺组织基因表达调控奠定了基础。     

哺乳动物卵母细胞及早期胚胎蛋白质组学研究进展

雌性生殖细胞发育是动物繁殖的基石,哺乳动物卵母细胞和早期胚胎在其生长发育过程中有许多独特的现象和规律,涉及一系列蛋白质合成/降解和磷酸化等状态的动态改变。对卵母细胞分裂、成熟调控机理以及植入前胚胎发育规律的研究是发育生物学领域的一项重要课题。蛋白质组学是以细胞或组织内全部的蛋白质为研究对象,系统鉴定、定量蛋白质并研究这些蛋白质功能的科学。随着蛋白质分离、鉴定技术的快速发展,蛋白质组学为卵母细胞发生、分化、成熟以及质量控制等相关研究提供了新的方法和内容,如在蛋白质定量、修饰、定位和相互作用等方面提供其他组学技术不可获得的重要信息。这些信息将有助于揭示哺乳动物卵母细胞成熟和早期胚胎发育的分子机制,对于进一步完善卵母细胞的体外成熟培养体系,提高胚胎体外生产、体细胞克隆和转基因动物生产效率具有重要意义。     

第三代慢病毒高效率包装系统的建立

慢病毒介导法是最有前途的转基因动物生产方法之一,高滴度慢病毒颗粒的包装是慢病毒转基因动物技术的关键.本研究应用含有增强型绿色荧光蛋白基因(eGFP)的第3代慢病毒载体系统,用脂质体转染法将慢病毒系统4质粒共转染293T包装细胞,培养48～72 h收集病毒上清液,通过超速离心进行浓缩,采用批量快速测定法(LaSRT)测定病毒滴度.结果显示,用脂质体转染法包装的慢病毒能成功地感染293T细胞,经检测病毒滴度达到5×108IU/mL以上,初步建成了高滴度慢病毒包装平台,为慢病毒介导制作转基因动物奠定了良好的研究基础.     

利多卡因醇质体的理化性质及其皮肤刺激性研究

目的:制备利多卡因醇质体,并对其理化性质及皮肤刺激性进行研究。方法:采用超声注入法制备利多卡因醇质体,使用透射电镜观察和激光粒度仪分析其形态、粒径大小及分布,采用透析法和HPLC法测定利多卡因醇质体的包封率,对不同温度下保存60天后的利多卡因醇质体的包封率进行测定以评估其稳定性,通过豚鼠皮肤刺激试验对利多卡因醇质体的皮肤刺激性进行分析。结果:利多卡因醇质体为圆形囊泡结构,粒径为31.33±2.63 nm,多分散指数为0.42±0.21,显示粒径分布较为均匀,其包封率为(52.85±0.36)%,保存在25±1℃时泄露最少,豚鼠完整及破损皮肤经利多卡因醇质体处理后均未见红斑和水肿反应,行组织学检查也未见明显炎症改变。结论:利多卡因醇质体具备理想的理化性质且对皮肤无刺激性,有望成为一种新型经皮局麻制剂。     

不同精子处理对应用ICSI-Tr技术生产转基因水牛胚胎效率的影响

本文主要探讨了不同精子处理对应用显微授精介导(intracytoplasmic sperm injection-mediated transgenesis,ICSI-Tr)生产转基因水牛胚胎效率的影响.本试验以p18T-BCN5.2-IFN-1.1pA-EGFP为载体,比较了精子的不同处理方式(NaOH和冻融)、NaOH处理精子不同时间(5 min,10 min,20 min,30 min和60 min)以及不同外源DNA浓度(5 ng/μL,10 ng/μL,25 ng/μL和50 ng/μL)对ICSI-Tr转基因效率的影响.结果显示:NaOH处理组的囊胚EGFP表达率(46.1%),与冻融精子处理组(47.1%)差异不显著,但发育率显著高于冻融处理精子组(28.3% vs 16.7%,P<0.05).处理60 min组和30 min组的分裂率分别为78.9%和77.5%,显著高于20 min、10 min和5 min组的64.0%、60.0%和64.0% (P<0.05),其中30 min处理组的囊胚EGFP表达率高达44.4%,显著高于其它处理组(P<0.05).25 ng/μL组和50 ng/μL组的早期胚胎EGFP表达效率差异不显著(41.3% vs 42.5%),但显著高于5 ng/μL组和10 ng/μL组(22.5%和35.5%),25 ng/μL组的囊胚EGFP表达效率显著高于其它组(P<0.05).本研究优化了应用ICSI-Tr生产转基因水牛胚胎技术体系,为获得ICSI-Tr转基因水牛奠定了良好的工作基础.     

猪成纤维细胞细胞周期同期化对核移植胚胎发育的影响

供体细胞所处的细胞周期及细胞周期同期化的方法对于体细胞核移植（somatic cell nuclear transfer,SCNT）的成功非常重要,本研究对血清饥饿培养处理与培养至完全汇合后的猪成纤维细胞周期同期化水平进行了检测。利用不同方法对猪成纤维细胞同期化处理后,通过流式细胞仪对细胞的细胞周期分布比率进行了检测。将细胞进行血清饥饿24⁷2h,显著地增加了G₀/G₁期的细胞百分率（92.2%⁹3.7%vs.77.8%,P<0.05）。将细胞培养至完全汇合后再培养24⁴8h,G₀/G₁期的细胞比例类似于血清饥饿法（94.4%,89.6%）。血清饥饿24h后,置换为10%FBS能逆转至生长期。用这两种不同方法处理后的体细胞作为核移植的供体构建重构胚,分裂率与囊胚率差异不显著（P>0.05）。结果表明,猪成纤维细胞通过血清饥饿法或者培养至汇合完全均能有效地将细胞周期同期化至G₀/G₁期,且均可作为体细胞核移植的供体细胞。     

水牛腔前卵泡的分离方法

为确定水牛腔前卵泡的有效分离方法 ,作者取用来自屠宰场 31头水牛的 6 1个卵巢 ,先用剪刀去掉髓质部 ,然后分别用梳刮法、剪碎法和显微分离法分离回收腔前卵泡。结果发现 ,使用梳刮法时 ,平均每个水牛卵巢回收所得的腔前卵泡数 (15 2 35± 4 4 81)明显高于剪碎法 (32 6 2± 14 81)和显微分离法 (8 95± 3 4 4 ) ,且其平均每个卵巢的处理时间 (39 0 5± 4 2 7min)明显少于剪碎法 (4 6 4 3± 4 15min)和显微分离法 (4 4 5 5± 7 82min)。梳刮法分离所得的腔前卵泡中 ,以原始卵泡最多 (占 4 1 2 5 % ) ,其次为初级卵泡 (占 38 79% ) ,而次级卵泡最少 (仅占 19 95 % )。用梳刮法获得的腔前卵泡在体外培养 72h后 ,存活率为 5 6 38% ,与剪碎法(4 8 91% )及显微分离法 (5 9 34% )没有显著差异。用梳刮法处理 10头黄牛的 2 0个卵巢 ,平均每个卵巢可分离获得 1195 2 0± 6 85 0 0个腔前卵泡 ,明显多于水牛的 15 2 35± 4 4 81个腔前卵泡。由此可见 ,梳刮法是水牛腔前卵泡的有效分离方法     

猪卵母细胞体外成熟的发育潜力及核移植重构胚构建方法的研究

为了提高猪体细胞核移植重构胚发育潜力,本研究对体外成熟28 h、32 h、36 h、40 h、44 h、48 h、52 h和56 h的猪卵母细胞分别进行去核构建重构胚.研究结果表明,成熟44 h的卵母细胞核移植后有较高的融合率(58.99%)、卵裂率(67.52%)和囊胚率(22.78%),而成熟48 h的卵母细胞则分别为56.51%、65.73%和15.96%;且卵龄为44 h的卵母细胞核移植后分裂率与囊胚率显著高于卵龄为40 h、36 h、32 h、28 h的卵母细胞的分裂率与囊胚率(P＜0.05).卵龄为48 h的卵母细胞融合率高于卵龄为52 h卵母细胞的融合率(P＜0.05).同时我们还探讨了不同去核方法(盲吸法、Hochest33342染色法和Spindle-view system)对猪体细胞核移植重构胚发育能力的影响.研究结果发现,盲吸法、Hoechest33342染色法和Spindle-view system法的去核率分别达到76.33%,100.00%和98.40%.Hoechest染色法去核率显著高于盲吸法的去核率(P＞0.05),而与Spindle-view法去核率没有差异(P＞0.05).三种方法在融合率和囊胚率方面差异不显著(P＞0.05),但Hoechest染色法的分裂率较低,差异显著(P＜0.05).进一步的研究表明,细胞质内注射进行核移植构建重构胚的分裂率和囊胚率分别为68.13%和6.44%;透明带下注射法则为60.37%和8.08%,两者差异不显著(P＜0.05);两者均可运用于猪体细胞的核移植,这为建立有效的猪体细胞核移植体系提供了参考.     

Gas6在猪卵母细胞及早期胚胎中表达模式与功能的初步研究

该研究通过免疫组化和QRT-PCR等方法系统分析了Gas6（growth arrest-special gene 6）基因在猪卵泡发生及早期胚胎发育过程中的表达规律,并提出了一种改良猪卵母细胞体外成熟系统的方法。研究结果显示,Gas6基因表达于猪卵巢中的卵母细胞细胞核及其周围的卵丘细胞,在卵母细胞体外成熟及早期胚胎发育过程中始终有表达,且在囊胚中表达最高。Gas6 mRNA在卵母细胞成熟过程中始终存在,但在孤雌激活后迅速消失,直到发育到囊胚时再次出现。在猪卵母细胞体外培养系统中添加不同浓度的Gas6重组蛋白培养卵母细胞,发现添加Gas6重组蛋白对卵母细胞的极体率无显著影响;但是当添加浓度为100 ng/mL时,培养的卵母细胞孤雌激活后分裂率、囊胚率及囊胚细胞数都显著增高。Gas6可能是通过改善卵母细胞细胞质的成熟质量提高卵母细胞的发育潜能,从而获得了更多、更好的胚胎。