大肠杆菌ptsG和ptsM突变体的构建及特性研究

目的：敲除大肠杆菌DH5α中与葡萄糖磷酸化转运相关的ptsG、ptsM基因,考察缺陷株生长特性及其可能的应用。方法：PCR扩增靶基因,构建两翼带有靶基因序列并嵌合抗药基因标记的线性片段,利用Red同源重组技术敲除靶基因。结果：成功敲除了大肠杆菌DH5α的ptsG和ptsM基因;在含有葡萄糖的LB培养基中,DH5αΔptsG最高菌密度是亲本的2.8倍,添加吡咯喹啉醌或导入其生物合成基因后能够产酸;DH5αΔptsM最高菌密度是亲本的4/10,有明显的产酸现象。结论：DH5αΔptsG可用于大肠杆菌高密度发酵和吡咯喹啉醌生物合成基因缺陷株筛选。     

大肠杆菌pqqL基因敲除与功能分析

【目的】通过构建大肠杆菌pqqL基因缺陷突变株,研究大肠杆菌pqqL基因的功能。【方法】首先通过PCR扩增得到pqqL基因和kan抗性基因,在体外构建线性打靶片段pqqL-kan-pqqL。然后通过Red同源重组敲除大肠杆菌的pqqL基因,构建大肠杆菌缺失突变体DH5αΔpqqL。在此基础上通过DCIP法检测山梨糖脱氢酶活性来比较大肠杆菌突变株与亲本株中PQQ合成的情况。【结果】成功敲除了大肠杆菌的pqqL基因,DCIP法检测结果显示大肠杆菌pBCP162/DH5αΔpqqL和pMD19T Simple-pqqABCDE/DH5α能够合成PQQ,而大肠杆菌pMD19T Simple-pqqABCDE/DH5αΔpqqL不能合成PQQ。【结论】大肠杆菌pqqL基因和pqqF基因具有同样的功能。     

乙内酰脲水解酶基因在大肠杆菌中的克隆表达

节杆菌BT801的乙内酰脲酶系能够水解5-苄基乙内酰脲生成L-苯丙氨酸,其中乙内酰脲水解酶负责乙内酰脲的水解开环。乙内酰脲水解酶的表达对于乙内酰脲酶的催化机制研究及氨基酸的生物不对称合成都具有重要意义。通过PCR技术扩增得到乙内酰脲水解酶基因(hyuH),置于表达载体pT221的,17启动子下游,将构建的重组质粒引入大肠杆菌BL21(DE3)。SDS-PAGE分析在相对分子量50kD处有一较强的表达带,经薄层扫描分析目的蛋白占全菌蛋白的40％,主要以可溶性形式存在,活性分析表明表达产物具有天然的酶活性。     

山梨糖脱氢酶和氨甲酰化酶的融合表达

利用大肠杆菌-生黑醋杆菌穿梭载体pUG18构建了山梨糖脱氢酶基因sdh和氨甲酰化酶基因hyuC的融合表达质粒pUG18-SDH-HyuC.在JM109/pUG18-SDH-HyuC中检测到山梨糖脱氢酶(SDH)和氨甲酰化酶(HyuC)的酶活性,大量的SDH和HyuC不以融合蛋白形式存在.将质粒pUG18-SDH-HyuC电转化至生黑醋杆菌H24,检测到HyuC活性,但尚未检测到SDH酶活性.从生黑醋杆菌转化子中提取质粒,重新转化至JM109,又可同时检测到SDH和HyuC活性,传代实验和对质粒的鉴定结果也说明该质粒在H24中稳定存在.     

α-乙酰乳酸脱羧酶在毕赤酵母中的分泌表达

根据已知的α-乙酰乳酸脱羧酶（ALDC）基因序列,通过PCR从枯草杆菌168基因组上扩增得到编码ALDC的结构基因。将该基因克隆到大肠杆菌一毕赤酵母穿梭载体pPIC9中,构建了重组质粒pPIC9-ALDC,电击转化毕赤酵母GS115。在甲醇诱导下,毕赤酵母分泌表达了ALDC。SDS—PAGE分析可见到Mr约62000的表达条带,经测定,表达产物活力为0．03U／mL。     

2例太岁样品分离菌的初步研究

目的:太岁是自然界中一种未知生命体,本实验对2例来源地不同的太岁样品进行菌株分离培养与鉴定。方法:太岁经表面消毒后无菌研磨,采用多种培养基涂板以分离可培养菌株,并进行16S rDNA、18S rDNA序列PCR扩增、测序及Blast比对。结果:从2例太岁样本中分别获得4株相似菌株,经鉴定,分离菌株TS-1为荧光假单胞菌(Pseudomonas flulorescens),TS-2为地中海短波单胞菌(Brevundimonas mediterranea),TS-3为红串红球菌(Rhodococcus erythropolis),TS-4为鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)。结论:2例来源不同的太岁中均含有上述4种菌株,在生物学组成中具有一定的共性,为研究太岁的形成提供了新的思路。     

人突触囊泡蛋白2C单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备人突触囊泡蛋白2C(SV2C)单克隆抗体。方法:纯化SV2C/L4蛋白,免疫BALB/c小鼠并制备杂交瘤细胞,筛选针对SV2C/L4的特异性抗体,鉴定亚型及测定效价;选取效价最高的抗体进行大量制备,并经SDSPAGE、Western印迹、间接ELISA和动物实验对抗体纯度、特异性、亲和力及中和活性进行检测。结果:得到纯度大于95%的SV2C/L4蛋白,经2轮筛选共获得13株鼠单抗,抗体重链大多为IgG1、IgG2a型,轻链均为κ型;选取效价最高的30号抗体进行大量制备,纯化后抗体的纯度大于99%,亲和力为6.7 nmol/L,中和活性为100 LD50/mg。结论:筛得1株高亲和力、具有中和活性的特异性SV2C鼠单抗,为肉毒中毒的治疗提供了新的选择,也为阐明Bo NT/A受体间的关系奠定了基础。     

未来气候变化对重庆榨菜种植适宜区的影响

榨菜为十字花科植物,是我国特有的经济作物,气候因子是影响榨菜种植分布的重要因素.通过收集榨菜分布的279个坐标点和22个高分辨率环境因子图层,利用MaxEnt模型进行重庆榨菜种植区预测,并基于该模型预测政府间气候变化专门委员会(IPCC)发布的RCP 2.6、RCP 4.5、RCP 6.0和RCP 8.5气候情景下21世纪50和70年代榨菜种植区分布范围.结果表明: MaxEnt模型的预测效果为优秀,其中,最湿月份降水量(贡献率为30.2%).年均温变化范围(17.2%)、最冷月份最低温(9.6%)、等温性(9.1%)、昼夜温差月均值(8.1%)和平均最高温度(7.5%)6个因子为主导因子,累积贡献率高达81.7％,且其各主导因子阈值分别为173～183 mm、27.2～28.3 ℃、1.8～3.8 ℃、22.5～24 ℃、6.2～6.8 ℃和14.8～18.0 ℃.在当前气候条件下,榨菜的适宜种植区比例为4.2%,主要集中在重庆涪陵的东北、西部和东部、长寿的东部和南部、垫江的南部和东南部、丰都的西北部和北部、忠县的东南部区域,以及武隆和南川的少部分区域等,中度适宜种植区面积比例为6.3%.在RCP 2.6、RCP 4.5、RCP 6.0和RCP 8.5气候情景下,预测21世纪50年代榨菜适宜生境的比例下降,分别为2.7%、3.8％、3.1％和3.2％;21世纪70年代比例也下降,分别为3.1%、3.7％、3.5％和2.9％,而中度适宜种植区的比例有所上升.     

CO2浓度升高和模拟氮沉降对青川箭竹叶营养质量的影响

通过研究大熊猫主食竹之一的青川箭竹(Fargesia rufa Yi)叶营养质量对CO2浓度升高和模拟氮沉降的响应,预测在气候变化下箭竹和大熊猫之间的取食关系,以期为大熊猫的长久保护提供科学参考.利用人工环境控制生长室对青川箭竹幼苗进行了1个生长季节的大气CO2浓度和施氮处理:(1)CON(对照,不添加N和环境CO2浓度),(2)EC(环境CO2浓度+350μmol/mol、不添加N),(3)EN(添加5gNm-2a-1、环境CO2浓度),(4)ECN(环境CO2浓度+350 μmol/mol、添加5 g N m-2 a-1).结果表明:EC处理对青川箭竹叶片的C含量无显著影响,但降低了叶片中N和P含量,从而导致C:N增加,而N:P没显著变化.另外,EC处理增加了叶片中可溶性蛋白、可溶性糖、淀粉、蔗糖和果糖的含量,但降低了木质素和纤维素含量.同时,EC也明显增加了叶片中防御物质单宁的含量.另一方面,EN处理显著降低了叶片中C的含量,并增加了N的含量,但没有改变P的含量,从而C:N减小,而N:P增加.EN显著提高了箭竹叶片可溶性蛋白、可溶性糖和木质素含量,减少了淀粉和纤维素,但对单宁无明显影响.ECN减少了箭竹叶的单宁和N、P的含量,但显著增加了叶的可溶性蛋白、可溶性糖、果糖、蔗糖和淀粉含量.大气CO2浓度升高和氮沉降对叶的N、单宁、可溶性糖和淀粉含量具有显著的交互作用.在未来气候变化情景下,箭竹叶营养质量提高将可能影响叶的生物化学过程以及箭竹-大熊猫之间的取食关系.     

山梨糖脱氢酶在脱氮副球菌中的表达

目的:在脱氮副球菌PD1222中表达山梨糖脱氢酶(SDH)。方法:从质粒pMD-18T上复制氨苄西林抗性基因Ampr,从酮古龙酸菌中复制SDH基因sdh,先后酶切连接到pIND4质粒上,构建pIND4-Ampr-sdh穿梭质粒;再把pIND4-Ampr-sdh电转入大肠杆菌S17-1λpir作为供体菌,脱氮副球菌PD1222为受体菌进行双亲本接合转移;挑取壮观霉素和氨苄西林双抗平板上的接合子进行培养,菌液PCR复筛接合子,测序鉴定,通过DCIP法和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测阳性克隆的SDH活性。结果:构建的质粒pIND4-Ampr-sdh成功转入脱氮副球菌PD1222中,SDH获得表达并检测到其蛋白活性。结论:实现了SDH在脱氮副球菌中的表达,为在脱氮副球菌中研究SDH的下游电子传递链奠定了基础。