Cry1Fa对Cry1Ac抗性棉铃虫的毒力评价

为了防治多种鳞翅目害虫, 表达Cry1Fa的转基因玉米和棉花已在美国商业化种植。明确棉铃虫Helicoverpa armigera对Cry1Fa与Cry1Ac的交互抗性及这两种杀虫蛋白之间的协同作用, 可以为表达 Cry1Fa+Cry1Ac的转双价抗虫棉花的合理应用提供依据。本实验测定了Cry1Fa对棉铃虫敏感品系（96S）及用Cry1Ac筛选的抗性品系（BtR, 抗性倍数2 194.15倍）的毒力, 发现Cry1Fa对敏感棉铃虫的毒力远低于Cry1Ac, LC₅₀值是Cry1Ac的504.80倍; 而且抗性品系BtR对Cry1Fa存在19.98倍的交互抗性。Cry1Fa与Cry1Ac混用可以提高Cry1Fa毒杀敏感棉铃虫的效果, 尤其是Cry1Fa浓度较低时, 加入Cry1Ac, 可以显著增加Cry1Fa的毒力; 但只有加入较高浓度的Cry1Fa时才能增加Cry1Ac的毒力。由于BtR品系已经对Cry1Ac产生抗性, Cry1Ac对抗性棉铃虫的毒力明显降低; 在较高浓度的Cry1Ac中加入Cry1Fa可以显著增加棉铃虫的死亡率（P=0.0015, F=6.88, df=6）, 但最高死亡率仅为58.33%。D-饱和最优试验的结果证实, Cry1Ac对于敏感棉铃虫的死亡率的影响达到显著水平（t₁=13.76﹥t_0.05）, Cry1Ac与Cry1Fa的交互作用对毒力的影响也达到显著水平（t₂₂=2.42﹥t_0.05; t₁₁=6.95﹥t_0.05; t₁₂=3.43﹥t_0.05）。Cry1Ac和Cry1Fa对抗性棉铃虫死亡率的影响都达到显著水平（t₁=3.03﹥t_0.05;t₂=2.59﹥t_0.05）, 但Cry1Ac是决定抗、 感棉铃虫死亡率的关键因素; Cry1Ac与Cry1Fa最佳浓度配比范围都是1.41~2.10 μg/cm2; 在抗性品系中, Cry1Ac和Cry1Fa的交互作用不显著。所以, 尽管Cry1F+Cry1A作物扩大了杀虫谱, 但棉铃虫对这两种蛋白存在交互抗性, 而且这两种蛋白混用对治理抗Cry1Ac棉铃虫的效果不理想, 因此不建议在中国种植表达Cry1F+Cry1A的棉花。关     

小分子热激蛋白基因HaHSP19.8在棉铃虫抗逆反应中的作用

【目的】小分子热激蛋白(small heat shock protein, sHSP)在昆虫抵御外界环境压力中至关重要。本研究旨在探究小分子热激蛋白sHSP19.8基因在棉铃虫Helicoverpa armigera生长发育、抵御高温胁迫和对Cry1Ac杀虫蛋白抗性机制中的作用,为更深入探析该基因作用机理及棉铃虫的防治奠定基础。【方法】通过PCR结合RACE克隆棉铃虫sHSP19.8基因序列,利用生物信息学软件对该基因序列进行分析;通过qRT-PCR测定Cry1Ac敏感棉铃虫5龄幼虫在40℃高温下处理1 h和2 h及饲喂含30 μg/mL Cry1Ac的人工饲料1 h和2 h后该基因的表达量,并测定抗感Cry1Ac棉铃虫不同发育阶段(1-5龄幼虫、蛹及成虫)和5龄幼虫不同组织(前肠、中肠、后肠、马氏管及表皮)中该基因的表达模式。【结果】获得了棉铃虫sHSP19.8基因的全长cDNA序列,命名为HaHSP19.8(GenBank登录号: XP_021195228.1),长608 bp,开放阅读框长528 bp,编码175个氨基酸残基,具有小分子热激蛋白的典型α-晶体结构域(α-crystallin domain, ACD)。该基因受40℃高温和30 μg/mL Cry1Ac杀虫蛋白诱导时在Cry1Ac敏感棉铃虫5龄幼虫中均过量表达;在Cry1Ac敏感棉铃虫整个发育阶段和5龄幼虫各组织中均表达,其中在成虫和5龄幼虫以及5龄幼虫表皮、马氏管和中肠内表达量较高;但是该基因在Cry1Ac抗性品系各个发育阶段和5龄幼虫各组织中表达量相比敏感品系都显著较低。【结论】结果说明HaHSP19.8参与棉铃虫生长发育和生理生化的过程,帮助昆虫抵御外界环境压力,并可能参与到棉铃虫对Cry1Ac的抗性机制中。     

棉铃虫Polycalin基因的克隆及其表达分析

【目的】通过对棉铃虫Polycalin基因的克隆及其表达谱分析,进一步明确Polycalin基因在抗性中发挥的作用,为棉铃虫Helicoverpa armigera的抗性治理提供理论依据。【方法】通过RACE结合PCR技术克隆获得了棉铃虫Polycalin基因的全长序列,利用实时荧光定量PCR技术测定了在棉铃虫不同发育时期、幼虫肠道不同部位的Polycalin基因表达量,比较了棉铃虫取食含Cry1Ac蛋白的饲料后,Polycalin基因表达量的变化。【结果】该基因全长序列为2 955 bp,开放阅读框为2 781 bp,编码926个氨基酸(Gen Bank登录号为KP100652);预测蛋白的分子量为101.68 ku,等电点为4.57。推导的氨基酸序列中,N末端含有20个氨基酸组成的信号肽,含有8个O-糖基化位点,3个N-糖基化位点,C末端存在2个GPI结合位点。Polycalin在棉铃虫所有发育阶段都可以表达,幼虫期表达量较高,尤其在1~3龄幼虫体内表达量最高,在卵、成虫和蛹中的表达量较低。棉铃虫4龄幼虫取食含活化Cry1Ac蛋白的人工饲料后,Polycalin基因的表达受到抑制。【结论】研究结果可以为进一步揭示Polycalin基因的功能及其在Bt杀虫机制中的作用奠定基础。     

二十一世纪以来棉花害虫治理成就与展望

本文对21世纪以来的20年间我国棉花害虫治理研究进展进行了回顾,从Bt棉花害虫种群地位演替、靶标害虫对Bt棉花抗性演化、棉花-害虫-天敌化学通讯三个方面总结了棉花害虫生物学与生态学研究进展,从预测预报、棉花抗虫性利用、生态调控、理化诱控、生物防治、化学防治等方面梳理棉花害虫防控关键技术研发概况,以棉铃虫、盲蝽两大主要害虫为例介绍了棉花害虫绿色防控技术体系创新应用。最后,从我国棉花产业发展现状出发,对今后一段时间我国棉花害虫防控研究与实践进行了展望。     

蛋白质组学技术的发展及其在昆虫中的应用

蛋白质组学在模式昆虫中的应用随着这些模式昆虫全基因序列先后完成而相继展开。蛋白组学作为一门有效而直观的研究整体蛋白质的方法,在非模式昆虫中应用也非常广泛。蛋白质组学在模式昆虫中主要应用于黑腹果蝇Drosophila melanogaster、家蚕Bombyx mori、冈比亚按蚊Anopheles gambiae、意大利蜜蜂Apis mellifera中;在非模式昆虫中主要应用在各种昆虫的生理、药剂毒理和化学生态学研究中。     

棉铃虫对Bt杀虫剂的抗性遗传方式

随着转基因棉花种植面积的日益增加,棉铃虫Helicoverpa armigera（Hübner)对Bt的抗性已经成为一个不容忽视的问题。发展转多价基因作物是当前缓解害虫对Bt抗性的最有效措施。本研究以经室内多年筛选的、抗性倍数达2 000多倍的Bt杀虫剂（含多种蛋白）抗性品系为材料,通过生物测定和不同的杂交试验,测定棉铃虫对Bt杀虫剂的抗性遗传方式,以期为Bt生物农药的抗性治理提供一定的依据,同时为制定棉铃虫对转多基因作物的抗性治理策略提供一定的参考。对敏感亲本和抗性亲本杂交产生的F1代的研究结果表明,杂交品系的抗性倍数分别为22.2倍和24.6倍;抗性显性度D值均小于0,分别为-0.20和-0.17,抗性为常染色体不完全隐性遗传。对4种回交后代和2种自交后代F2的研究结果表明,实际死亡率与期望死亡率差异较大,说明抗性是由单基因多个位点或多基因控制。     

共生菌Asaia在四种鳞翅目害虫中的感染情况

【目的】Asaia属醋酸菌已被证明与双翅目、膜翅目、半翅目和鳞翅目的多种昆虫存在着重要的共生关系。本研究检测斜纹夜蛾Prodenia litura(Fabricius)、粘虫Mythimna separata Walker、小地老虎Agrotis ypsilon Rottemberg和甘蓝夜蛾Mamestra brassicae Linnaeus体内Asaia的感染情况,并研究了Asaia的传递效率。【方法】基于16 s r DNA特异序列检测,分析Asaia在4种鳞翅目害虫中的感染情况。通过建立感染Asaia的斜纹夜蛾品系,检测其垂直传递效率。【结果】Asaia在斜纹夜蛾、粘虫、小地老虎和甘蓝夜蛾田间种群中均有感染,其感染率分别为45.8%、66.7%、47.2%和31.0%。系统发育分析表明,Asaia 16S r DNA序列可分为3种序列型ST1、ST2和ST3,其中4种昆虫中均含有ST1序列型。父母亲本均感染Asaia的斜纹夜蛾后代,Asaia感染率达到91.7%。【结论】Asaia在鳞翅目害虫中存在较高的感染率,在昆虫物种间可能存在水平传递并且在种内可进行垂直传递。     

棉铃虫围食膜蛋白的电泳分离技术

比较了棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)围食膜不同处理方法,不同围食膜数量,在不同电泳下的分离效果,筛选最佳的围食膜蛋白分离技术。结果表明:冷冻干燥与非冷冻干燥处理围食膜后进行SDS-PAGE电泳分离效果基本相同,建议使用冷冻干燥后处理较好。取1、3、5条围食膜进行SDS-PAGE电泳,都能将围食膜蛋白分离,且分离效果基本一致,建议5条围食膜最合适,具有可靠性和代表性。浓缩胶为5%、分离胶分别为8%、10%和12%时棉铃虫围食膜的SDS-PAGE电泳分离效果差异不大,而分离胶为12%时效果较好。无水三氟利克酸处理围食膜后进行NuPAGE电泳,分离出的围食膜蛋白大约30多种,远远超过上述方法分离的16²0种,且需要的围食膜材料少,分离效果最佳,但费用高。     

乙基多杀菌素对棉铃虫解毒酶和乙酰胆碱酯酶活性的影响

【目的】乙基多杀菌素(Spinetoram)是一种新型杀虫剂,为深入了解其对棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)的作用效果和作用机制,本研究测定了我国不同地区田间棉铃虫种群对乙基多杀菌素的敏感基线,并比较了不同剂量(LC15、LC40、LC60和LC80)处理后棉铃虫体内解毒酶和乙酰胆碱酯酶活性的变化。【方法】采用药膜法,对采自不同地区的田间棉铃虫幼虫进行了毒力测定;采用酶标板动力学方法测定了乙基多杀菌素处理对棉铃虫幼虫4种酶活性的影响。【结果】乙基多杀菌素对棉铃虫有很好的胃毒效果,与阿维菌素相比,乙基多杀菌素杀虫活性高、见效快、不同地区间差异小;乙基多杀菌素处理后棉铃虫羧酸酯酶和谷胱甘肽-S-转移酶活性显著降低,且随着处理剂量的增加活性下降明显,各剂量处理后棉铃虫两种酶活性抑制率分别为52.14%~89.46%和8.09%~49.81%;而棉铃虫在取食含乙基多杀菌素的饲料后,各处理组棉铃虫多功能氧化酶活性表现为先升高、再降低、再升高的趋势,LC15剂量处理时活性最高,比对照增加147.75%;乙酰胆碱酯酶活性随处理剂量增加逐渐升高,活性最高比对照增加96.69%。【结论】乙基多杀菌素对棉铃虫的杀虫效果明显优于阿维菌素,具有广阔的应用前景;乙基多杀菌素处理棉铃虫引起羧酸酯酶和谷胱甘肽-S-转移酶活性降低、乙酰胆碱酯酶和多功能氧化酶活性升高。     

棉铃虫感觉神经元膜蛋白基因克隆和表达

从棉铃虫Helicoverpa armigera触角中克隆了一条全长1 690 bp的cDNA序列,该序列阅读框全长1 572 bp,编码523个氨基酸残基,序列中有2个跨膜区,具有昆虫感觉神经元膜蛋白（sensory neuron membrane protein, SNMP）的典型特征。SNMP与已报道的其他昆虫的感觉神经元蛋白的氨基酸序列有很高的同源性。半定量RT-PCR研究结果显示,SNMP在棉铃虫中不仅在触角中表达,也在去掉触角的头、足中表达。但是在触角中的表达量最高,在雌雄触角中的表达量差异不显著。在喙、下颚须和下唇须中也有表达。SNMP在卵、蛹和成虫体内也都有表达,但在卵中表达量相对较低。将SNMP编码区克隆到表达载体pET21b中,成功地进行了原核表达,表达出带有6个组氨酸标签的重组蛋白。