差异柠檬酸杆菌GXW-1 β-葡萄糖苷酶的酶学性质及分子改造

【目的】筛选鉴定1株产β-葡萄糖苷酶的菌株,克隆、表达该菌株中的β-葡萄糖苷酶基因,研究重组酶的酶学性质并进行分子改造。【方法】在自然界中采集土样,筛选到1株具有β-葡萄糖苷酶活性的菌株,对野生菌进行16S rDNA鉴定,比对分析Gen Bank数据库中与野生菌同属的β-葡萄糖苷酶基因序列,设计简并引物PCR扩增基因保守区;设计引物扩增目的基因,以pQE30为表达载体构建重组质粒,转化至大肠杆菌中进行诱导表达;采用镍亲和层析对重组酶进行纯化,研究其酶学性质;采用易错PCR和定点随机突变相结合的方法对野生型β-葡萄糖苷酶进行分子改造。【结果】一个来自于差异柠檬酸杆菌GXW-1的β-葡萄糖苷酶基因被克隆并在大肠杆菌中表达。酶学性质研究结果表明该β-葡萄糖苷酶CBGL的最适温度为45°C,最适p H为6.0,V_(max)值是(0.1704±0.0073)μmol/(mg·min),K_(cat)值为(0.2380±0.0102)/s。CBGL能水解α-pNPG、甜菊苷、黄豆苷和染料木苷。对野生酶进行分子改造,获得V_(max)是野生酶2.54倍的突变体W147F。【结论】CBGL不仅具有β-1,4-糖苷键水解能力,还可能具有一定的α-糖苷键水解酶活性。此外,CBGL还能够水解天然底物甜菊苷、黄豆苷和染料木苷。这些特性表明该β-葡萄糖苷酶在理论研究及在工业中有一定的应用价值。     

阴沟肠杆菌和大肠杆菌的生物化工发酵能力比较研究

本研究通过对Escherichia coli JM109菌株和E.cloacae gxas菌株的碳源利用能力、菌株的生长优势以及胞内发酵产物组成进行了研究。实验结果表明:在碳源利用测试中E.coli JM109结果表现阳性(+)只有8种,阴性(-)有32种,而E.cloacae gxas阳性(+)有38种,阴性(-)只有18种,具有广泛的碳源谱。比较2株菌株的生长曲线发现E.cloacae gxas比E.coli JM109生长快,稳定期具有更高的生物量。GC-MS分析结果显示两个菌株的发酵产物的差异极大,在多尺度面上没有重合点。以大肠杆菌为对照菌株,阴沟肠杆菌的发酵产物中有14 776个化合物的产量比大肠杆菌高,只有7 725个化合物的产量比大肠杆菌低。因而,阴沟肠杆菌在生物化工发酵应用中比大肠杆菌更具潜力优势。     

利用木薯淀粉产异丁醇的重组菌株的构建

目的:构建了一株直接利用木薯淀粉为原料生产异丁醇的重组菌株。方法:将地衣芽孢杆菌的淀粉酶基因克隆到生产异丁醇的大肠杆菌重组菌中,使大肠杆菌能够直接利用木薯淀粉为原料生产异丁醇。结果:木薯淀粉不需要预先加入淀粉酶进行糖化处理,就可以直接被作者研究所构建的重组菌株发酵生成异丁醇。结论:提供了一种直接发酵木薯淀粉生产异丁醇的方法。导入地衣芽孢杆菌的淀粉酶基因,能使只能利用葡萄糖作为发酵材料的异丁醇生产工程菌直接利用木薯淀粉为原料生产异丁醇。