家蚕蛹变态期丝腺组织的退化与细胞凋亡特征

利用形态学观察方法、分子生物学检测方法以及20-羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone)和放线菌酮(cycloheximide)体外培养方法, 研究了家蚕Bombyx mori 蛹变态期丝腺组织的退化与细胞凋亡特征。显微镜的观察显示家蚕丝腺的逐渐退化发生在吐丝期间。DNA梯度电泳的分析表明程序性细胞死亡(programmed cell death)可能伴随发生在丝腺的退化过程中。在离体培养条件下, 用20-羟基蜕皮酮处理5龄第6天幼虫的丝腺, 导致的细胞凋亡提前于对照, 提示在进入蛹变态期前, 20-羟基蜕皮酮提早激发了介导家蚕丝腺细胞凋亡与水解机制的遗传调控级联系统。上述结果表明, 20-羟基蜕皮酮能够诱导家蚕丝腺组织在蛹变态期发生程序性细胞死亡。     

家蚕二分浓核病毒VD1-ORF4基因截短多肽的表达和抗体制备

通过PCR扩增家蚕二分浓核病毒(Bombyx mori bidensovirus,BmBDV)VD1-ORF4基因序列中的两个DNA片段,将测序正确的两个目的片段分别亚克隆到原核表达载体pET-30a上,通过不同浓度的IPTG对含有重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导,对诱导产物进行SDS-PAGE和Westen blot分析.结果表明,这两个截短多肽都获得了表达,其N-端融合有6个组氨酸.将割胶纯化的蛋白多肽与佐剂充分研磨,以研磨后的匀浆液对昆明小鼠进行皮下多点注射.获得的抗血清分别对原核诱导表达产物进行Western blot分析,结果表明,在特定的位置都能杂交到一条特异的蛋白带,表明制备的两个多抗能为深入研究VD1-ORF4基因的功能提供基础.     

家蚕神经肽基因的筛查及成熟肽的预测

神经肽（neuropeptide）是家蚕Bombyx mori体内重要的调控物质。为了充分理解神经肽对家蚕发育的调控, 扩充家蚕神经肽的数量, 本研究利用BLAST的tblastn程序结合OpenOffice软件的查找程序, 基于其他昆虫和无脊椎动物神经肽的同源性和保守的结构特点, 在家蚕基因、理论蛋白质数据库及NCBI中进行全面而系统的基因筛查; 并利用各种在线工具对所筛查到基因和理论蛋白质的结构和成熟肽进行预测分析。结果共获得allatostatin-A （AST-A）, allatostatin-B （AST-B）, allatostatin-C （AST-C）, allatropin (AT), ecdysis-triggering hormone （ETH）, crustacean cardioactive peptide (CCAP)和FMRFamide等31个神经肽基因家族, 包括37个神经肽基因亚家族, 共计44个神经肽基因; 预测出193个成熟的神经肽, 其中73个根据家族同源性预测在C末端发生酰胺化, 而6个被预测在N末端发生了环化, 9个被预测酪氨酸发生了硫酸化。大部分成熟神经肽都具有明显的家族结构特征, 但proctolin, CCAP及CAPA-PK成熟肽结构上与其他昆虫相比有所扩展。结果提示, 家蚕神经和内分泌细胞产生了几乎在所有昆虫中具有的神经肽前体; 进化过程中大部分成熟神经肽的氨基酸序列在种间产生了差异, 但家族特征性基序高度保守。本研究为神经肽功能研究以及神经肽对家蚕发育尤其是蛹期发育调控的研究奠定了基础。     

“两广二号”家蚕抗病毒基因Bmlipase-1和BmSP-2克隆与原核表达

本研究以优良杂交品种"两广二号"家蚕为试材,克隆了该杂交品种家蚕两个抗家蚕核型多角体病毒(BmNPV)基因:脂肪酶基因Bmlipase-1和丝氨酸蛋白酶基因BmSP-2,测序并分别与不同品种蚕的同源基因序列进行比较。结果显示,"两广二号"家蚕Bmlipase-1基因ORF长度为885bp,编码294个氨基酸,BmSP-2扩增长度为855bp,编码284个氨基酸;它们的核苷酸和推导氨基酸序列同源性皆达92%以上,Bmlipase-1更保守,同源性大于99%";两广二号"家蚕的Bmlipase-1基因脂肪酶活化部位和BmSP-2基因酶催化三联体位点的氨基酸残基与不同品种蚕的完全相同。以上结果说明这两个抗病毒基因在蚕的遗传进化过程中高度保守,提示其可能在机体消化或者免疫防御方面起着重要生理作用。将这两个抗病毒基因在大肠杆菌BL21中进行融合表达,获得的融合Bmlipase-1和BmSP-2蛋白分子量分别为47kD和42kD左右。     

家蚕微孢子虫孢壁蛋白与其发芽的相关性

为了研究孢壁蛋白与家蚕微孢子虫发芽（孢原质弹出）的相关性,我们采用碳酸钾诱导微孢子虫体外发芽结合密度梯度离心的方法（简称GDGC法）,收集纯化发芽后的孢子空壳（简称孢壳）,对发芽液、纯化的孢壳及成熟孢子的孢壁蛋白组分进行了分析。结果表明：GDGC法可以获得高纯度孢壳,计算出其密度为1．130g/cm^3;与发芽前成熟孢子提取的孢壁蛋白相比,空孢壳可以提取到主要孢壁蛋白SWP32、SWP30、SWP25,同时发现SWP32、SWP25丰度有所降低;结合碳酸钾发芽液的蛋白电泳分析,发现孢壳上丰度降低的SWP32在发芽液蛋白样品中存在,LC—MS／MS数据分析也发现SWP32、SWP30、SWP25在碳酸钾处理液中都有存在;而用碳酸钾溶液处理冷冻孢子时,未观察到发芽现象,电泳结果显示此时K2CO,溶液中只有SWP30条带,说明在碳酸钾溶液诱导的发芽过程中SWP32和SWP25从孢壳上脱落可能与发芽相关而不是被碱性的碳酸钾溶解下来的[动物学报54（6）：1068—1074,2008]。     

家蚕线粒体ND2、COⅠ和若干tRNA基因的克隆及序列分析

克隆并测定了家蚕（Bombyx mori）线粒体基因组3468bp的EcoRⅠ和HindⅢ双酶一段序列,根据序列同源性比较,该DNA片段包括3个蛋白质编码基因：ND2基因、COⅠ基因和COⅡ基因5′端399bp的序列,以及6个tRNA基因和一个尚待确定的tRNA^Met基因。家蚕与果蝇的ND2基因序列同源性约69.7%,COⅠ基因的同源性约83.8%,COⅡ基因5′端的同源性约80％,这表明细胞色素氧化酶基因在物种间比烟酰胺腺漂呤二核苷酸脱氢酶基因保守,6个推定的tRNA基因序列与果蝇相应tRNA基因序列差异较大,另外,除tRNA^Chn基因的二级结构相似外,其它tRNA基因的二级结构与果蝇相应tRNA基因的二级结构也有较大差异。     

家蚕遗传资源库

生物物种的遗传性状是由基因支配的.同一物种不同品系的遗传基因组成存在差异。为了尽可能地保存和利用某一物种的遗传基因,科技人员将物种的各种品系收集起来以便研究、保护、利用,这种品系的集合叫做该物种的遗传资源库,又称基因库。我国是家蚕的起源国,拥有最丰富的家蚕遗传资源。早在1897年,杭州太守林迪臣于西湖之滨创立"蚕学馆",收集整理蚕品种达1200多种,但以突变基因资源为中心内容的家蚕基因库的构建始于20世纪初的日本九州大学,他们至今保存家蚕突变基因系统约450个。中国始于其后的20世纪30     

柘叶饲养对家蚕消化液中抗核多角体病毒（BmNPV）相关蛋白活性的影响

为探讨柘叶Cudrania tricuspidata饲养家蚕Bombyx mori易感染核多角体病毒（BmNPV）的机制, 本实验比较研究了分别以柘叶和桑叶Morus alba饲养家蚕后其消化液中抗病毒蛋白活性的差异。结果表明: 家蚕经柘叶饲养后消化液中红色荧光蛋白（red fluorescent protein, RFP）的强度无明显变化, 但柘叶饲养蚕消化液中脂肪酶、 胰蛋白酶的活性显著低于桑叶饲养蚕, 柘叶饲养蚕消化液中脂肪酶和胰蛋白酶的活性分别为1 421.71±202.60 U/L和19.67±8.17 U/mL, 桑叶饲养蚕脂肪酶和胰蛋白酶的活性分别为1 976.03±139.92 U/L和199.18±181.71 U/mL。这些结果说明, 消化液中脂肪酶和胰蛋白酶的活性水平低与柘叶饲养蚕易感染核型多角体病毒（BmNPV）可能相关。     

镉胁迫对家蚕脂肪体脂质过氧化物含量及抗氧化酶活性和mRNA表达的影响

【目的】探讨鳞翅目模式昆虫家蚕Bombyx mori作为重金属污染的监测指示生物在镉胁迫下的酶反应及相关的基因表达。【方法】给家蚕幼虫期全龄添食镉(Cd²⁺), 调查不同性别家蚕5龄幼虫脂肪体中脂质过氧化物丙二醛（MDA）的含量, 超氧化物歧化酶（SOD）、 过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性及其基因表达水平的变化。【结果】Cd²⁺胁迫对雌雄家蚕MDA 含量均具有浓度效应关系, MDA含量随Cd²⁺胁迫浓度的升高而增加。Cd²⁺胁迫下, SOD和CAT活性表现为先升后降的变化趋势, Pearson相关性分析显示SOD和CAT活性变化有显著相关性(雄: R=0.770, P=0.001; 雌: R=0.854, P=0.000）。雌性家蚕脂肪体中CAT活性变化和Cat mRNA水平的表达具有正相关性（R=0.712, P=0.003）。雄性家蚕脂肪体中GSH-Px活性随Cd²⁺胁迫浓度的升高而增加, 显示浓度 效应关系, 12.5~50 mg/kg Cd²⁺胁迫组GSH-Px活性与对照相比有显著差异（P<0.05）, 其活性和GSH-Px mRNA水平的表达具有正相关性（R=0.834, P=0.000）; 雌性家蚕脂肪体中GSH-Px活性表现为先升后降的变化趋势, 12.5 mg/kg Cd²⁺胁迫组GSH-Px活性与对照相比有显著增加（P<0.01）。【结论】结果表明, 急性镉胁迫对家蚕脂肪体有明显的毒性作用, 其作用机制与脂质过氧化加剧和抗氧化酶活性变化有关。家蚕对重金属镉的解毒机制有性别相关性。