抗重组人表皮生长因子单克隆抗体的制备及生物学特性鉴定

建立能稳定分泌特异性抗重组人表皮生长因子(rhEGF)单克隆抗体的杂交瘤细胞株 ,制备出高效价的 ,具有生物学活性的抗重组人表皮生长因子单克隆抗体 ,为EGF及其单克隆抗体在肿瘤生长调节中的作用研究 ,为肿瘤的诊断与治疗提供具有实用价值的研究工具。此外 ,为EGF的亲和层析纯化提供材料。以BALB/c小鼠脾细胞为饲养细胞 ,运用细胞杂交瘤技术制备 ,间接ELISA法筛选出能稳定分泌针对人表皮生长因子的单克隆抗体细胞株 ;对杂交瘤细胞进行染色体核型分析并以体内诱生法产生腹水以获得大量单克隆抗体 ,并采用HiTrapProteinAHP柱对其纯化…     

慢病毒siRNA靶向干扰YAP基因胃癌细胞株的建立

目的：构建并鉴定YAP基因短发夹干扰RNA（shRNA）慢病毒载体,建立稳定干扰YAP基因表达的胃癌细胞株SGC7901。方法：荧光定量PCR检测YAP基因在多种胃癌细胞株中的表达情况。构建重组靶向YAP基因的shRNA慢病毒表达质粒PGC-shRNA-YAP,用脂质体转染的方法将载体导入胃癌细胞。经杀稻瘟菌素筛选后,建立稳定表达siRNA的细胞株。荧光定量PCR检测干扰效率。结果：在胃癌细胞株SGC7901中,YAP基因显示高表达。测序验证PGC-shRNA-YAP重组质粒构建成功。将重组质粒稳定转染入胃癌细胞株SGC7901后能明显抑制YAPmRNA表达水平。结论：成功构建了PGC-shRNA-YAP慢病毒重组质粒,建立了靶向稳定干扰YAP基因表达的siRNA胃癌细胞株SGC7901。     

NALP1 基因与骨肉瘤细胞的相关研究

目的:探讨NALP1基因在骨肉瘤细胞株MG-63、U-2OS中的表达,以及高表达NALP1基因对于骨肉瘤细胞体外凋亡的影响。方法:使用RT-PCR、Western-blot法检测骨肉瘤细胞株MG-63、U-2OS中的mRNA及蛋白表达水平并与人成骨细胞株hFOB1.19比较。将NALP1基因转染质粒PcDNA3.1,将重组质粒转染骨肉瘤细胞,分成高表达基因组、空质粒组及对照组,加入抗肿瘤药物顺铂及甲氨蝶呤促使肿瘤细胞凋亡,使用流式细胞仪测定各组肿瘤细胞凋亡率。结果:通过统计分析,骨肉瘤细胞株MG-63、U-2OS中的mRNA及蛋白表达水平均低于人成骨细胞株hFOB1.19(P<0.05),NALP1高表达组的肿瘤细胞凋亡率明显高于空白质粒组及对照组。结论:上调骨肉瘤细胞株MG-63、U-2OS中的NALP1的表达量可以促进肿瘤细胞凋亡。     

已建株鼻咽癌细胞的PLUNC基因启动子区序列多态性分析

目的检测人类标准鼻咽癌细胞中是否存在已知的PLUNC基因启动子-437bp-＋87bp区域的单核苷酸多态性（SNP）。以便进一步探索SNP与鼻咽癌的关系。方法采用PCR产物直接测序的方法,对7株体外培养的鼻咽癌细胞基因组DNA的PLUNC基因启动子区进行序列分析。结果发现7株PLUNC基因的启动子区皆存在已知的3个SNP位点（1888、2128和N2）和未知一个突变位点（N1）,其测观杂合度分别为85．7％、100％、100％和28．6％。其中3个已知SNP位点在筛查的细胞株中均存在T-C的突变,而且SUNE-1鼻咽癌细胞株的1888位点基因型为突变纯合子CC型。结论体外培养的标准鼻咽癌细胞株中存在已知的3个SNP位点（1888、2128和N2）的突变现象,且突变率为100％;1888位点鼻咽癌易患型（CC型）已在体外稳定建株;首次发现启动子-195bp区域N1突变位点。     

上调OPN和TIP30表达对口腔鳞癌cal-27细胞的影响

目的:探讨上调骨桥蛋白(OPN)和TIP30表达对口腔鳞状细胞癌cal-27细胞增殖和迁移能力的影响。方法:采用过表达OPN载体病毒和过表达TIP30质粒分别感染或转染cal-27细胞株后,通过实时荧光定量PCR法和蛋白印迹western blot法检测OPN和TIP30的表达,CCK-8法检测细胞增殖能力,细胞划痕实验检测细胞的迁移能力。结果:过表达OPN载体病毒感染的cal-27-sh OPN细胞株OPN m RNA和蛋白的表达均明显高于cal-27-sh N细胞株(P0.001,P=0.002),且细胞的增殖能力和迁移能力强(P0.001,P=0.002)。过表达TIP30质粒转染的cal-27-p TIP30细胞株TIP30 m RNA和蛋白的表达均明显高于cal-27-pc3.0细胞株(P=0.001,P=0.003),且细胞的增殖能力和迁移能力弱(P0.001,P=0.005)。结论:OPN能促进cal-27细胞的增殖和迁移,TIP30抑制cal-27细胞的增殖和迁移。     

人肝癌细胞p53基因的表达及其对细小病毒H-1的敏感性

本文利用单链构象多态性分析,17号染色体短臂等位基因杂合性分析,Northern印迹,免疫沉淀,p53基因第7外显子酶切等技术检测了两个中国人肝癌细胞系SMMC-7721,YY-8103和一个自发转化的人肝细胞系L-02的p53基因结构与表达。实验表明,这三个细胞系中没有出现17号染色体短臂等位基因杂合性缺失,第4—9外显子也没发生突变,但其mRNA和蛋白表达水平很低。利用MTT比色分析法研究了这三个细胞系和其他已知p53基因背景的八个人肝癌细胞系(QGY-7703、PLC/PRF/5、Huh-7、Hep3B、FOCUS、Tong/ HCC、SK-Hep-1、HepG2)对自主性细小病毒H-1的敏感性。除HepG2细胞外,其他十个细胞系p53基因的结构和/或表达都不正常。经H-1感染(moi=20)后,其敏感性均高于HepG2细胞。本研究初步表明了p53基因结构或表达的不正常可能导致人肝癌或转化细胞对H-1的敏感性的提高。     

DLC-1基因表达对结肠癌细胞侵袭转移能力的影响

目的:研究DLC-1基因对结肠癌细胞侵袭迁移能力的影响.方法:将DLC-1 shRNA(短发夹状RNA,short hairpin RNA)序列克隆到质粒pGCsi-U6/Neo载体,采用脂质体介导的转染方法将构建的DLC-1 shRNA表达质粒转入结肠癌细胞系LoVo细胞.采用RT-PCR技术和Western Blot技术分别检测LoVo细胞中DLC-1mRNA和蛋白表达水平的变化.Transwell小室人工重组基底膜侵袭转移实验观察LoVo细胞侵袭迁移能力的改变.结果:结肠癌细胞系LoVo细胞表达DLC-1分子.所构建质粒表达载体能有效地干扰LoVo细胞DLC-1 mRNA和蛋白质表达水平;Transwell小室人工重组基底膜侵袭转移实验结果显示,转染后LoVo细胞侵袭转移能力明显增强(p＜0.05).结论:结肠癌细胞系LoVo细胞表达DLC-1基因,应用RNAi技术可特异性降低其表达.DLC-1的表达水平与结肠癌细胞侵袭转移相关.     

在食管癌细胞增殖过程中蛋白酶激活受体-2(PAR-2)对细胞周期蛋白D1(CyclinD1)的调控机制*

目的:探讨在食管癌细胞增殖过程中蛋白酶激活受体-2(PAR-2)影响细胞周期蛋白D1(CyclinD1)的机制。方法:方法:使用食管癌EC109细胞株,实验分为:空白对照组、PAR-2激动组(加入激动剂SLIGKV)、PAR-2反激动组(加入反激动剂VKGILS)、PAR-2 shRNA组(PAR-2shRNA成功转染)和MAPK抑制组(加入阻滞剂PD98059);取对数生长期的细胞,以6×10⁴cells/ml的密度接种于培养瓶中,置于孵育箱中培养24 h后使用PBS清洗3次,更换为无血清的1640培养基培养24 h,之后各实验组按实验设计分别加入所需试剂,每组设置3个复孔,于孵育箱中继续培养24 h,采用RT-PCR法检测PAR-2、ERK1、CyclinD1的mRNA的表达水平;采用Western blot法检测PAR-2、ERK1、p-ERK1、CyclinD1的蛋白表达水平。结果:与空白对照组相比,PAR-2激动组PAR-2mRNA、ERK1 mRNA、和CyclinD1 mRN表达明显升高(P＜0.05),PAR-2、p-ERK1和CyclinD1蛋白表达升高(P＜0.05);PAR-2 shRNA组PAR-2mRNA、ERK1 mRNA和CyclinD1 mRNA表达降低(P＜0.05),PAR-2、p-ERK1和CyclinD1蛋白表达降低(P＜0.05);MAPK抑制组ERK1 mRNA和CyclinD1 mRNA表达明显降低(P＜0.05),p-ERK1和CyclinD1表达降低(P＜0.05)。结论: PAR-2可通过MAPK通路调节CyclinD1的表达从而促进食管癌细胞EC109的增殖。     

双丁酰环磷酸腺苷耐人肝癌细胞株SMMC－7721表面N－糟链类型及天线数的影响

本文采用系列凝集素柱层析法,并配合外切精苷酶研究了在双丁酰环磷酸腺苷（ｄＢ－ｃＡＭＰ）作用１～５天过程中人肝癌细胞株ＳＭＭＣ－７７２１细胞表面Ｎ－糖链类型及复杂型糖链天线数的变化。结果表明,ｄＢ－ｃＡＭＰ促进３Ｈ—Ｍａｎ参入细胞表面Ｎ－糖链,使高甘露糖型Ｎ－糖链的百分比下降,并促进二天线Ｎ－糖链的生物合成。使多天线特别是四天线和Ｃ２Ｃ２Ｃ６三天线Ｎ－糖链的百分比减少．结果提示,Ｎ－糖链结构的这些变化可能是ｄＢ－ｃＡＭＰ诱导ＳＭＭＣ－７７２１细胞向正常方向分化的结果。     

参杞合剂对人鼻咽癌细胞CNE细胞周期及凋亡的影响

目的研究参杞合剂(SQ)在体外对CNE细胞周期及凋亡的影响。方法应用MTT法观察参杞合剂对细胞的抑制作用,流式细胞术观察不同浓度参杞合剂作用不同时间后CNE细胞周期的改变,电镜结合DNA电泳分析参杞合剂诱导凋亡的作用。结果SQ对CNE细胞生长有明显抑制作用,且其作用强度呈现出对浓度和时间的依赖性。CNE细胞在SQ作用下随着时间的延长和浓度的增加,G0/G1期比率下降,S期比率升高,出现S期阻滞。0.0625 g.生药/ml的SQ作用48 h后诱导出凋亡,凋亡率随着浓度的增加、时间的延长而增加,电镜下可见典型凋亡小体。琼脂糖凝胶电泳呈现出凋亡特征性的DNA条带。结论参杞合剂可直接杀伤肿瘤细胞,其机制可能通过阻滞细胞周期S期,诱导肿瘤细胞凋亡实现的。