氨酰tRNA合成酶作用机制及其应用

氨酰tRNA合成酶（aminoacyl tRNA synthetases, aaRSs）通过催化氨基酸与相应tRNA的氨酰化以保证遗传信息翻译的准确性,在生物体内具有重要作用。近年来,随着对aaRS催化机制理解的不断加深,aaRS的应用逐渐成为研究热点。在细菌中,aaRS活性被抑制后会导致其生命活动发生紊乱,根据aaRS在人体与病原菌内不同的催化特点设计针对病原体的特异性aaRS抑制剂,将有助于开发以aaRS为靶标的新型抗生素。另外,通过突变aaRS可以在蛋白质序列中定点掺入非天然氨基酸,扩展蛋白质工程。本文简述了aaRS的分类、结构与功能的特点,并在此基础上综述了aaRS在研发新型抑制剂,设计改造特殊蛋白质等方面的应用。     

微生物蛋白质谷氨酰胺酶的初步分离纯化

蛋白质谷氨酰胺酶可以特异性地水解蛋白质和多肽的谷氨酰胺残基,研究了产吲哚金黄杆菌产生的微生物蛋白质谷氨酰胺酶的代谢曲线和初步的分离纯化。发酵过程中pH升高,氨浓度增加,到14 h时酶活达到最高为0.359 U/mL。发酵液离心去上清液经3 kD滤膜超滤4倍时,纯化倍数和得率都最高。超滤液加入4倍体积无水乙醇沉淀蛋白质,酶的得率最高为72.7%。沉淀用缓冲液复溶后,经过SP-Sepharose Fast Flow离子交换层析分离,得到单一峰。经过多步纯化后酶得率为31.72%,纯化倍数为124倍,经SDS-PAGE电泳鉴定为单一条带,分子量约为20 kD。     

人谷氨酰胺:6-磷酸果糖酰胺转移酶的体外表达、纯化及活性检测

目的:制备重组谷氨酰胺∶6-磷酸果糖酰胺转移酶(GFAT),检测其活性。方法:利用RT-PCR扩增人肝脏cDNA中GFAT1基因全长片段,克隆到表达载体pET32b中;在大肠杆菌Origami(DE3)中诱导表达,用镍离子螯合柱(Ni-NTA)纯化重组GFAT1;用体外酶学的方法检测GFAT的活性。结果:构建了pET32b-GFAT1质粒,经诱导表达及纯化,得到具有一定生物活性的GFAT。结论:利用原核表达系统可得到具有良好生物学活性的重组人GFAT1。     

遮阴对柠檬香茅中萜类化合物及其合成酶基因影响研究

为获取柠檬香茅(Cymbopogon citratus)中萜类化合物及其合成酶基因信息,以正常生长及遮阴下的柠檬香茅嫩叶为材料,进行代谢组学和转录组学结合q RT-PCR验证分析。代谢组分析结果表明,柠檬香茅所含萜类共23种,包括单萜4种、倍半萜4种、二萜8种、三萜3种和四萜4种。在遮阴下,柠檬香茅的二萜类银杏内酯C和四萜类虾青素相对含量更高。转录组测序结果表明,单萜生物合成涉及4类合成酶的24个基因,二萜生物合成涉及11类合成酶的49个基因,倍半萜和三萜生物合成涉及12类合成酶的58个基因,其中6类合成酶的8个基因在遮阴下的相对表达量显著提高,而前萘二烯加氧酶(c64786.0)基因正好相反。q RT-PCR分析表明,遮阴下4个FPKM值差异明显的萜类合成酶基因表达的变化趋势与转录组测序结果一致,但不同合成酶基因的差异表达量存在差异。因此,柠檬香茅所含4类共23种萜类化合物由27类合成酶共131个基因编码而来,不同光照强度影响9个合成酶基因的表达和2种萜类化合物含量。     

效应面法优化CHO细胞培养基中几种丰要成分的含量

目的：考察培养基中葡萄糖、谷氨酰胺、血清、碳酸氢钠含量对CHO细胞生长繁殖的影响。方法：在CHO细胞培养基中添加不同成分的葡萄糖、谷氨酰胺、血清、碳酸氢钠,通过单因素实验结果结合Box-Behnken效应面法,根据二次回归模型的分析结果,以细胞表达蛋白体外活性为指标进行实验,考察培养基中葡萄糖、谷氨酰胺、血清、碳酸氢钠含量对细胞生长繁殖的影响。结果：根据回归方程分析结果,作出相应的曲面图和等高线图,优选出培养基中各组分的最佳配比为：葡萄糖2．54g／L、谷氨酰胺O．59g／L、血清8．3％,碳酸氢钠2．96g／L。结论：Box—Behnken实验设计法用于细胞培养过程中考察培养基中各组分的优选是可行的,数学模型的预测值与实验观察值相符。通过对CHO细胞培养基成分的优化,使CHO细胞蛋白表达量高,有利于提高产品质量和降低生产成本。     

大鼠谷氨酰胺转运蛋白SNAT2-EGFP融合蛋白的表达与鉴定

谷氨酰胺转运蛋白是中枢神经系统中一种重要的中性氨基酸转运蛋白,对谷氨酰胺的跨膜转运十分重要。为了更方便地研究大鼠谷氨酰胺转运蛋白2(SNAT2)在细胞膜上的表达与定位,利用亚克隆技术将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)构建于SNAT2的C端,通过菌液PCR、酶切和DNA测序鉴定重组真核表达质粒;将测序正确的重组质粒瞬时转染人胚胎肾细胞(HEK293T cells),用Western blot和激光共聚焦电子显微镜荧光检测技术鉴定SNAT2-EGFP的表达与亚细胞定位。结果表明,SNAT2-EGFP融合蛋白重组质粒在细胞中表达并正确定位于细胞膜上。SNAT2-EGFP融合蛋白重组质粒的成功构建为今后深入研究SNAT2的结构和功能提供了一个有效的工具。     

黄秋葵查尔酮合成酶基因AeCHS的克隆与表达分析

采用同源序列克隆和RT-PCR技术,首次克隆得到黄秋葵查尔酮合成酶基因(CHS)cDNA全长序列。序列分析表明,该序列全长1175 bp,包括一个1170 bp的完整ORF,编码389个氨基酸,命名为AeCHS。生物信息学分析表明,本研究所获得的AeCHS氨基酸序列与同科植物黄蜀葵和陆地棉的同源性较高,分别达99.23%和97.44%,AeCHS推断的氨基酸序列含有CHS蛋白的标签序列GFGPG以及4个保守活性位点Cys164、Phe215、His303、Asn336。实时荧光定量PCR分析黄秋葵果实、花、叶片不同发育时期AeCHS基因的表达量,结果表明AeCHS基因在上述植物材料中表现出不同的表达模式:花>果实>叶片,具体到不同植物组织,AeCHS基因在生长6 d的果实、盛开的花朵以及植株顶端第4片叶子中的表达量较高。     

甘蓝型油菜水苏糖合成酶基因克隆及表达分析

以甘蓝型油菜品种‘德油5号’为试材,采用RT-PCR和RACE方法首次从油菜中获得水苏糖合成酶基因cDNA全长序列,命名为BnSTS,GenBank登录号为HQ285880.1。该cDNA全长3 210bp,包含一个长为2 619bp的开放阅读框,编码873个氨基酸。通过构建原核表达载体,成功表达出预期蛋白。同源性比对结果显示,该基因编码蛋白与拟南芥STS相似性最高为82.08%。荧光定量PCR结果显示,基因表达水平与油菜种子发育过程中水苏糖含量变化具有相关性,与种子脱水耐性的获得具有时间一致性。该基因可能在种子脱水耐性形成机制中具有一定的作用。     

乌头碱抑制GSK-3β对抗β淀粉样蛋白诱导的神经细胞损伤

本研究旨在探讨乌头碱抑制糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)对抗β淀粉样蛋白片段140(Aβ1-40)诱导的神经细胞损伤的药理作用.基于细胞安全性测试设置5 nmol/L为后续实验的乌头碱适宜浓度.以20 μmol/L的Aβ1-40孵育24 h建立SH-SY5Y神经细胞损伤细胞模型.设置3个实验分组:正常对照组、Aβ1-...     

体外培养的哺乳动物细胞的葡萄糖和谷氨酰胺代谢

综述体外培养哺乳动物细胞的葡萄糖和谷氨酰胺代谢。大部分的葡萄糖通过糖酵解途径为细胞提供中间代谢物质和能量 ,最终生成乳酸 ,只有很少部分进入TCA循环和磷酸戊糖途径。谷氨酰胺通过谷氨酰胺酶生成谷氨酸 ,并进一步通过谷氨酸脱氢酶或转氨酶生成α -酮戊二酸进入TCA循环 ,为细胞提供中间代谢物质和能量。糖酵解和谷氨酰胺代谢 (glutaminolysis)受葡萄糖和谷氨酰胺的影响而相互调节。