梨果黑斑病菌AaCaMK基因克隆、生物信息学分析及其在侵染结构分化中的表达分析

[背景] 钙/钙调素依赖型蛋白激酶（Calcium/Calmodulin-Dependent Protein Kinase,CaMK）是真核生物细胞钙信号途径中钙调素下游的一类重要靶蛋白,对病原物生长、胁迫响应及致病性等具有重要的调控作用。[目的] 对梨果黑斑病菌互隔交链孢（Alternaria alternata）AaCaMK基因进行克隆、生物信息学分析,并对其在侵染结构分化过程中的基因表达情况进行分析,为进一步研究梨果黑斑病菌钙离子信号途径中AaCaMK对A.alternata侵染结构分化调控的分子机制提供一定的理论依据。[方法] 采用同源克隆法从A. alternata JT-03中克隆得到3个AaCaMK基因;通过TMHMM、ProtScale、SOPMA等软件对AaCaMK基因进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR （RT-qPCR）技术分析AaCaMK在梨果黑斑病菌侵染结构分化过程中的表达情况。[结果] 克隆得到片段分别为1 212、1 200、2 349 bp的AaCaMK1、AaCaMK2和AaCaMK3基因;生物信息学分析表明,AaCaMK1、AaCaMK2和AaCaMK3均含有典型的蛋白激酶超家族催化结构域（PKC_Like Superfamily）,并且AaCaMK1和AaCaMK2共同含有CaMK类丝/苏氨酸蛋白激酶催化结构域（STKc_CaMK）,AaCaMK3含有LKB1/CaMKK类丝/苏氨酸蛋白激酶催化结构域（STKc_LKB1_CaMKK）;同源性分析表明,AaCaMK1、AaCaMK2和AaCaMK3分别与玉米大斑病菌CAK1、CAK2和CAK3的相似性高达94.32%、97.49%和86.57%;RT-qPCR分析表明,AaCaMK1、AaCaMK2和AaCaMK3在疏水及果蜡诱导A. alternata侵染结构分化过程中均显著上调表达（P<0.05）,而且果蜡诱导作用更显著。其中AaCaMK1和AaCaMK2在附着胞形成时期（6 h）表达量为对照的1.51倍和3.05倍,而AaCaMK3在侵染菌丝形成阶段（8 h）表达量最高,为对照的2.86倍,并且在果蜡诱导下,这3个基因在芽管伸长阶段（4 h）的上调表达量显著高于疏水界面。[结论] 钙信号中AaCaMK基因在疏水及果蜡诱导A.alternata侵染结构分化过程中发挥重要的调控作用。     

猪流行性腹泻病毒S蛋白胞内区线性B细胞表位最小基序鉴定

[背景] S蛋白是猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV）的主要结构蛋白和免疫原性蛋白,在前期的研究中,本课题组在S蛋白的胞内区鉴定到2个包含线性B细胞表位的短肽。[目的] 鉴定PEDV S蛋白胞内区线性B细胞表位的最小基序。[方法] 原核表达2个短肽的每次后移1个氨基酸的系列8肽,以兔抗S蛋白血清为一抗,通过Western Blot筛选阳性反应8肽,鉴定S蛋白胞内区线性B细胞表位的最小基序。[结果] S蛋白胞内区的2个包含线性B细胞表位的短肽共享一个表位,该表位的最小基序为¹³⁷¹QPYE¹³⁷⁴。同源性分析显示该B细胞表位基序为保守性表位。[结论] 确定了S蛋白胞内区线性B细胞表位的最小基序为¹³⁷¹QPYE¹³⁷⁴;S蛋白抗原表位的鉴定有助于提高对其结构和功能的理解。     

黄芪汤对延缓C离子辐射致大鼠肾组织细胞凋亡的影响及相关机制

目的: 探讨黄芪汤抑制¹²C⁶⁺离子辐射脑模型鼠肾组织细胞凋亡的分子保护机制。方法: 50只SPF级Wistar大鼠随机分为正常对照组,单纯辐射模型组,黄芪汤(高、中、低剂量)组。正常对照组和单纯辐射模型组给予等体积生理盐水灌胃10 ml/(kg·d),黄芪汤治疗组分别灌胃给予黄芪汤18、9、4.5 g/(kg·d),连续给药2周。7 d后除正常对照组外,其余各组大鼠脑组织给予4Gy ¹²C⁶⁺离子束单次照射,辐射后第7日处死各组大鼠。HE染色法观察大鼠肾脏的病理形态变化,ELISA法检测大鼠血清IL-6的含量,实时荧光定量PCR法测定大鼠肾脏Bcl-2、Bax和Caspase-3的基因表达,免疫组化法检测大鼠肾脏Bcl-2、Bax、Caspase-3和NF-κB的蛋白表达。结果: 与正常对照组比较,单纯辐射模型组体重和肾脏指数均显著降低,血清IL-6的含量显著升高,肾脏Bcl-2的基因表达和蛋白表达均显著降低,Bax和Caspase-3的基因表达和蛋白表达均显著升高,NF-κB的蛋白表达也显著升高(P＜ 0.01),单纯辐射组肾小球系膜细胞明显增生,肾小管间质血管明显扩张充血,肾小管管腔狭窄、不规则。与单纯辐射模型组相比,黄芪汤高剂量组体重和肾脏指数均明显升高,黄芪汤各干预组肾脏Bcl-2的基因表达和蛋白表达均显著升高(P＜0.05或P＜0.01);而黄芪汤中、高剂量组Bax和Caspase-3的蛋白表达均显著降低,各干预组血清IL-6的含量显著降低,肾脏Bax和Caspase-3的基因表达均显著降低,肾脏NF-κB的蛋白表达显著下降(P＜0.05或P＜0.01),黄芪汤高剂量组可见肾小球系膜细胞增生情况明显改善,肾小管轮廓清晰。结论: 黄芪汤对¹²C⁶⁺离子辐射脑模型鼠的肾损伤具有一定的防护作用,其作用机制可能与调控Bcl-2/NF-κB信号通路有关。     

云南省急性弛缓性麻痹病例中柯萨奇病毒B5感染情况及病毒基因特征分析

为了解云南省急性弛缓性麻痹(Acute flaccid paralysis,AFP)病例中柯萨奇病毒B组5型(Coxsackievirus B5,CV-B5)感染情况及病毒基因特征,采用回顾性研究的方法,收集AFP监测系数据资料,描述CV-B5感染AFP病例的流行病学特征及临床表现;对CV-B5分离株进行完整VP1区逆转录-聚合酶链反应扩增和核苷酸序列测定,测序结果进行同源性分析和系统发生学研究.结果显示,15例CV-B5阳性的AFP病例散在分布于7个云南省内州市、贵州省及缅甸;男女比例为1∶2,5岁以下儿童占73.3％,53.3％(8/15)的病例麻痹时伴发热,以双侧下肢麻痹(66.7％,10/15)为主,临床诊断多为肌炎(33.3％,5/15),1例病例残留麻痹.CV-B5云南株之间以及与原型株之间的核苷酸同源性分别为75.0％～100.0％和77.2％～82.0％.云南本地存在两个基因型的CV-B5共循环,大多数云南株(16株)与中国大陆CV-B5分离株均属于D基因型(D3亚型),另外两株云南株属于国外优势流行的C基因型,与其他云南株之间存在较大的核苷酸差异(20.4％～25.0％).本研究描述了 CV-B5云南地方株的分子流行病学特征,首次发现我国存在C基因型.研究显示分离自不同疾病来源及健康人群的CV-B5在亲缘关系树上无特异性区分.     

小檗碱通过JNK通路调控柯萨奇病毒B3感染心肌细胞凋亡的作用

小檗碱是具有细胞保护作用的生物碱,能够在柯萨奇病毒B3(CVB3)感染引起的病毒性心肌炎小鼠中发挥心肌保护作用,但具体的机制未阐明。在内皮细胞中,小檗碱通过c-Jun氨基末端激酶(JNK)通路抑制细胞凋亡,因此本研究将分析小檗碱通过JNK通路调控CVB3感染心肌细胞凋亡的作用。H9c2心肌细胞分为对照组(不含药物的DMEM处理)、模型组(含CVB3的DMEM处理)、小檗碱组(含CVB3及小檗碱的DMEM处理)、小檗碱+JNK质粒组(含CVB3、小檗碱、JNK质粒的DMEM处理),检测细胞凋亡率、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)的含量、p-JNK、cleaved caspase-3、bax、bcl-2的表达量。结果显示,模型组的细胞凋亡率、TNF-α、IL-6、ROS、MDA的含量、p-JNK、cleaved caspase-3、bax的表达量高于对照组,bcl-2的表达量低于对照组(P<0.05);小檗碱组的细胞凋亡率、TNF-α、IL-6、ROS、MDA的含量、p-JNK、cleaved caspase-3、bax的表达量低于模型组,bcl-2的表达量高于模型组(P<0.05);小檗碱+JNK质粒组的细胞凋亡率、TNF-α、IL-6、ROS、MDA的含量、p-JNK、cleaved caspase-3、bax的表达量高于小檗碱组,bcl-2的表达量低于小檗碱组(P<0.05)。以上结果表明小檗碱对CVB3感染心肌细胞的凋亡具有抑制作用,抑制JNK通路是介导这一作用可能的分子机制。     

基于实测高光谱与Sentinel-2B数据的银北土壤Na+含量估测

为了探讨不同传感器对土壤Na⁺含量的估测能力,本研究以宁夏银北地区典型样点土壤实测光谱和Sentinel-2B影像光谱为对象,运用逐步回归(SR)和主成分回归分析(PCA)方法对光谱数据进行敏感参量筛选,然后采用偏最小二乘回归(PLSR)、支持向量机(SVM)和反向传播神经网络模型(BPNN)分别建立实测光谱和影像数据的土壤Na⁺含量估算模型。结果表明: 除Band9外,实测重采样数据与影像数据呈极显著相关。基于SR筛选方式建立的模型估算精度普遍高于PCA(SVM模型除外),PCA-SVM模型为影像最佳Na⁺含量估算模型,预测精度为0.792;SR-BPNN模型为实测最佳Na⁺含量估算模型,预测精度达到0.908。经重采样实测光谱模型校正后的SR-PLSR影像光谱土壤Na⁺含量估算模型精度从0.481提高到0.798,有效提高了较大尺度下的土壤Na⁺含量估算精度。本研究实现了遥感监测土壤Na⁺含量由点向面的空间转换,为Sentinel-2B影像监测盐渍化土壤Na⁺含量提供了科学参考。     

金银花提取物对重症急性胰腺炎肺损伤大鼠的保护作用及机制研究

摘要 目的：探讨金银花提取物对重症急性胰腺炎肺损伤大鼠的保护作用及其分子机制。方法：选择60只大鼠并将其分为假手术组、模型组、金银花低剂量组、金银花中剂量组和金银花高剂量组。比较各组的肺组织和胰腺组织病理评分。采用全自动血气分析仪检测各组大鼠血氧分压、二氧化碳分压和氧合指数。采用酶联免疫吸附法检测各组炎症因子[白细胞介素（IL）-1、IL-6和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）]水平。免疫印迹法检测各组肺组织中NF-κB通路相关蛋白（p-p65、p-IκBα、p65和IκBα蛋白）水平。结果：与假手术组相比,模型组肺组织和胰腺组织病理评分以及二氧化碳分压明显升高（P<0.05）。与模型组相比,金银花各剂量组肺组织和胰腺组织病理评分以及二氧化碳分压明显下降,并且呈剂量依赖性（P<0.05）。与假手术组相比,模型组血氧分压和氧合指数明显下降（P<0.05）。与模型组相比,金银花各剂量组血氧分压和氧合指数明显升高,并且呈剂量依赖性（P<0.05）。与假手术组相比,模型组IL-1、IL-6和TNF-α水平以及p-p65和p-IκBα蛋白水平明显升高（P<0.05）。与模型组相比,金银花各剂量组IL-1、IL-6和TNF-α水平以及p-p65和p-IκBα蛋白水平明显下降,并且呈剂量依赖性（P<0.05）。结论：金银花提取物对大鼠重症急性胰腺炎肺损伤具有一定保护作用,能够升高血氧分压和氧合指数并降低二氧化碳分压,并且其保护作用可能是通过抑制NF-κB通路介导的促炎症因子IL-1、IL-6和TNF-α的产生,缓解炎症性肺损伤。     

脐带间充质干细胞对卵巢早衰家兔的治疗效果及机制研究

摘要 目的：分析脐带间充质干细胞对卵巢早衰家兔的治疗效果及机制研究。方法：经腹腔连续注射 2 d 环磷酰胺50 mg/（kg?d）建立卵巢早衰家兔模型。将建模成功的10只家兔随机分成模型组和治疗组,每组5只。建模一周后,治疗组家兔每天经耳缘静脉注射5×10⁶/mL脐带间充质干细胞混悬液2 mL,连续注射3 d。模型组家兔经耳缘静脉注射等量无菌生理盐水。于治疗后 0 d、7 d、14 d和28 d,取家兔静脉血检查血清激素表达水平。于治疗后28 d,检测家兔卵巢中生长卵泡数、封闭卵泡数、黄体数、富半胱氨酸蛋白61（CYR61）和结缔组织生长因子（CTGF）mRNA及蛋白质相对表达量。结果：治疗前,模型组和治疗组家兔血清雌二醇（E₂）、促卵泡生成素（FSH）、FSH/黄体生成素（LH）、抑制素B（INHB）和抗苗勒管激素（AMH）、均无显著差异（P＞0.05）。与模型组相比,治疗后治疗组家兔血清E₂和INHB水平显著上升（P＜0.05）,FSH水平显著下降（P＜0.05）,FSH/LH均无显著差异（P＞0.05）。随着治疗时间延长,治疗组家兔血清E₂和FSH水平周期性波动。治疗28 d后,与模型组相比,治疗组家兔血清AMH水平显著升高（P＜0.05）;卵巢组织中CYR61和CTGF mRNA及蛋白质相对表达量均显著升高（P＜0.05）;生长卵泡数显著升高（P＜0.05）;封闭卵泡数和黄体数均显著降低（P＜0.05）。结论：静脉注射脐带间充质干细胞可通过上调CYR61和CTGF的表达,促进卵泡生成,恢复卵巢功能,达到治疗卵巢早衰的临床效应。     

HEPIS的表达谱及其在直肠癌中的表达分析

HEPIS是一个新基因,关于HEPIS的表达和功能尚不十分清楚.本研究首先构建了HEPIS的表达载体pEGFP-C3-HEPIS,采用双荧光素酶报告实验检测了 HEPIS对Wnt、CRE、NF-KB和HRE信号通路的作用,随后采用RNA原位杂交(RISH)检测了 HEPIS在12种不同器官(乳腺,结肠,食道,肾,肝,肺,卵巢,胰腺,前列腺,直肠,胃和宫颈)的癌组织和正常组织的表达差异,并且检测了 HEPIS在40例直肠腺癌和直肠正常组织的表达.研究表明,在293T细胞转染pEGFP-C3-HEPIS后,无论是转录水平还是翻译水平,HEPIS均显著增加,且HEPIS可以显著抑制Wnt、CRE和NF-KB 3条信号通路,对NF-κB信号通路的抑制最为显著.RNA原位杂交实验证实HEPIS在12个器官的癌组织和正常组织中表达存在明显的表达差异.采用GEPIA对HEPIS在直肠癌及正常组织的表达差异进行了分析,结果表明HEPIS在正常直肠组织高表达,进一步采用RISH分析了 HEPIS在40例直肠癌和癌旁组织的表达差异,分析表明HEPIS在正常直肠组织的表达显著高于癌组织(P＜0.01),与GEPIA分析结果一致,说明HEPIS可能是直肠癌的一个潜在抑癌基因.     

基于转录组测序探究ATP7B基因缺陷小鼠铜累积诱导肝细胞自噬的相关机制*

目的：分析ATP7B基因缺陷(Wilson's disease,WD)小鼠肝脏组织中自噬相关基因的表达和自噬相关蛋白的相互作用方式,探讨铜累积诱导肝内自噬活化的可能机制。方法：对4周龄和12周龄WD小鼠肝组织进行铜含量检测和转录组测序,对差异基因进行GO和KEGG富集分析,筛选自噬相关差异基因做qRT-PCR和Western blot验证,采用GeneMANIA数据库构建自噬相关差异蛋白的互作网络(PPI)并进行功能注释分析,抑制自噬相关蛋白的表达分析其对自噬的影响。结果：与野生型小鼠相比,WD小鼠肝铜含量显著升高,铜累积导致基因表达模式改变;基于GO数据库统计自噬相关差异基因数目,4周龄和12周龄分别有8个、51个,基于KEGG数据库统计,4周龄和12周龄分别有5个、19个;筛选Ulk1、Ddit4、Plk3等9个基因进行qRT-PCR,定量结果与测序结果表达趋势基本一致;其编码的蛋白质通过共表达、共定位等方式互相作用;Western blot结果显示铜累积导致Ulk1、Plk3、Park2蛋白表达显著增加和细胞自噬发生,抑制Ulk1、Plk3、Park2的蛋白质表达可显著下调细胞自噬水平。结论：WD不同阶段的铜累积可调节肝脏多个自噬相关基因的表达,通过其编码的自噬相关蛋白的互相作用共同诱导肝脏自噬活化以缓解肝损伤。