化学修饰对胰激肽释放酶稳定性及其性质的影响

以自制高活性ＰＰＫ为材料，在氰基硼氢化钠存在下经水溶性乙醛酸修饰其表面氨基，使基抗不可逆热失活稳定性有显著提高，结果表明，修饰ＰＰＫ在等电点等基本性质方面都有变化，修饰ＰＰＫ的ＢＡＥＥ活性为天然酶的８２％，氨基修饰度为５８％，抗蛋白酶水解，贮藏和冻干稳定性都有加强。     

运用CRISPR/Cas9技术构建表达10rolGLP-1的降糖酵母

为研发一种用于治疗2型糖尿病的新型生物药物,本研究运用实验室前期构建的10rolglp-1基因和CRISPR/Cas9基因组编辑技术创建了重组酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)工程菌株。构建了向导RNA(guide RNA,gRNA)表达载体pyES2-gRNA、供体载体pNK1-L-PGK-10rolGLP-1-R和Cas9表达载体pGADT7-Cas9,将这些表达载体共转化酿酒酵母INVSc1菌株,通过同源重组途径敲入PGK-10rolGLP-1表达单元,最终得到具有降血糖功能、高表达10rolGLP-1的酿酒酵母。通过SDS-PAGE和蛋白质印迹,筛选出2种稳定表达10rolGLP-1的酿酒酵母重组菌株。降血糖实验结果表明,重组降血糖酿酒酵母对糖尿病小鼠模型具有显著的降血糖作用,其血糖下降平缓,可避免引起低血糖风险。体重变化和多尿等其他症状也明显改善,表明本研究构建的口服降血糖酿酒酵母有望成为一种简单有效、经济实用的糖尿病生物药物。     

重组胰酶在四价流感病毒裂解疫苗(MDCK细胞)制备中的应用

目的 探究使用重组胰酶(recombinant trypsin, RT)替代N-(对甲苯磺酰基)-L-苯基乙基氯甲基酮(N-p-Tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone, TPCK)处理的牛源胰蛋白酶(TPCK-trypsin, TT),在基于无血清悬浮细胞培养的四价流感病毒裂解疫苗制备中的可行性。方法 用不同浓度的RT处理无血清悬浮培养的犬肾细胞(madin-darby canine kidney cell,简称MDCK细胞),检测其对细胞密度和细胞活力的影响。在流感病毒感染环节添加不同浓度的RT,在不同时间细胞收获病毒液，检测病毒滴度，确定适合的RT浓度。在2μg/mL RT的条件下，接种不同(亚)型流感病毒毒株，以检测不同时间病毒滴度及细胞密度，并在3 L生物反应器中验证RT对流感病毒扩增的影响。结果 当RT浓度<5μg/mL时，对无血清悬浮培养的MDCK细胞生长密度和细胞活力均无显著影响；在病毒感染与扩增过程中，添加终浓度为2μg/mL RT可保证不同(亚)型流感病毒疫苗株的有效扩增。其中，H1N1、H3N2、B/Vic、B/Ya...     

核糖核酸酶A超家族：不仅仅是一组降解RNA的酶

核糖核酸酶A超家族(ribonuclease A superfamily; RNase A superfamily),也称脊椎动物分泌型核糖核酸酶超家族(vertebrate secreted ribonucleases superfamily),是二十世纪蛋白质结构、酶学和分子进化领域研究最多最广泛的核糖核酸酶家族。自上世纪初期从牛胰腺中分离鉴定第一个成员以来，已从哺乳动物、两栖动物、爬行动物、鸟和鱼等几百种动物中鉴定了几千个成员。早期对该家族成员的研究不仅促进了蛋白质化学技术的发展，而且为现代生物学研究奠定了基础。目前已知人的核糖核酸酶A超家族成员包括8个典型成员(RNase 1～RNase 8)和5个非典型成员(RNase 9～RNase 13)。功能方面，曾一度以为该家族成员只具有降解核糖核酸的能力。随着血管生成素(angiogenin; RNase 5)、嗜酸性粒细胞衍生神经毒素(eosinophils-derived neurotoxin, EDN; RNase 2)、嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(eosinophils cationic protein, ECP; RNase ...