古老的绿色基因和神奇的PCR技术

大约在2000万年之前,怒吼的狂风席卷爱达荷州北部地区。在一个行将枯竭的湖泊旁,一片木兰树叶从树枝上慢慢落下,很快沉入到污浊而又寒冷的水底。随着时光的流逝,这片树叶被夹在泥浆和页岩之间。1989年,这片古老的树叶被一个科学研究小组发掘出     

TaqMan实时荧光定量PCR鉴定燕窝方法的建立

目的:燕窝是一种名贵药材,但目前市场上有很多假冒产品,因此需要建立一种简便可靠的鉴定方法。方法:通过荧光定量PCR对燕窝样品进行检测,对雨燕属、金丝燕属和其他物种细胞色素b基因的序列进行分析。结果:设计了一条特异靶向雨燕属和金丝燕属细胞色素b基因的TaqMan探针,发现此探针具有良好的特异性和灵敏度,可检测痕量的燕窝样品,对其他物种的检测结果为阴性。结论:所设计的TaqMan探针和实时荧光PCR方法可应用于燕窝的真伪鉴别,准确性高、实用性强。     

猪苓菌丝形成菌核的MAPK基因克隆及表达分析

【目的】克隆药用真菌猪苓MAPK基因并进行生物信息学分析及表达模式研究。【方法】利用5′-RACE-PCR技术从猪苓菌丝中克隆得到MAPK基因全长,利用生物信息学软件推测蛋白的理化性质、结构域;DNA Star对氨基酸进行多序列比对;用MEGA 5.0做进化关系分析;借助实时定量PCR检测基因表达模式。【结果】猪苓MAPK基因的全长cDNA为1 293 bp,其中编码区占1 161 bp,共编码386个氨基酸,推测分子量为43.872 kD,理论等电点为6.68。猪苓的MAPK有MAPK中ERK1/2类型的保守区。系统进化树结果显示猪苓MAPK蛋白属于担子菌类群。实时荧光定量PCR分析结果表明猪苓菌核形成初期,菌核中的MAPK表达量显著高于菌丝组织,随着菌核的快速生长而减少。【结论】猪苓MAPK基因PuMAPK的分子特征为进一步研究其在猪苓菌丝形成菌核过程中的作用奠定基础。     

巴尔通体感染性心内膜炎的研究进展

感染性心内膜炎一直是威胁人类健康的重要疾病之一。近年来人类正面临着此病发病率持续上升的局面,其诊断、治疗和预防依然是目前需要解决的重要临床和公共卫生问题。本文介绍了感染性心内膜炎疾病的最新研究进展,分析了国内外报道的538份巴尔通体感染性心内膜炎的病例,重点阐述了巴尔通体和相关心内膜炎的流行病学、实验室诊断、治疗以及发病的危险因素和预防控制措施。预测这些研究将对人类理解和控制巴尔通体感染性心内膜炎具有重要的指导意义。     

二斑叶螨对联苯菊酯抗药性的PASA快速检测技术建立与应用

【目的】二斑叶螨Tetranychus urticae Koch是世界性的重要农业害螨,其抗药性发展严重阻碍了对该螨的科学防控。为了实现田间二斑叶螨对菊酯类杀虫剂抗药性的早期快速检测,本研究拟建立二斑叶螨对联苯菊酯的特异性等位基因PCR(PCR amplification of specific alleles,PASA)检测技术。【方法】玻片浸渍法测定了联苯菊酯对二斑叶螨不同种群的毒力,克隆了二斑叶螨钠离子通道结构域IIIS6的DNA片段,基于该片段中包含的抗性和敏感种群中的点突变,建立了PASA检测技术,并应用于二斑叶螨不同种群中抗性基因F1538I点突变频率的检测。【结果】与室内相对敏感种群相比,二斑叶螨北京通县和海南三亚种群均对联苯菊酯产生了抗药性,LC50分别为1 982.6 mg/L和2 767.4 mg/L,抗性倍数分别为6.0倍和8.4倍;PASA检测结果表明二斑叶螨室内相对敏感种群中存在杂合子个体,F1538I点突变频率为10.0%,而北京通县和海南三亚种群中该突变频率则分别达50.0%和53.3%。【结论】建立的PASA技术可以快速检测二斑叶螨田间种群是否存在与击倒抗性相关的基因点突变,从而判断其对菊酯类杀虫剂的抗药性发展。     

褐飞虱热胁迫下内参基因的筛选及热激蛋白基因表达分析（英文）

【目的】褐飞虱Nilaparvata lugens(Stl)是为害水稻的重要害虫之一,温度是影响其暴发、迁飞的主要环境因子之一。本研究旨在探讨研究褐飞虱对高温胁迫适应性的热激蛋白基因表达调控模式。【方法】分别以不同的高温(30℃~40℃)处理褐飞虱雌、雄虫1 h和2 h,利用荧光定量PCR技术检测其体内的β-actin 1,β-actin2,β-actin3,28S rRNA,18S rRNA和α-2-tubulin 6个内参基因的表达量,用geN orm和BestK eeper软件分析确定最稳定表达的内参基因,并检测热胁迫后hsp70和hsp90基因在处理褐飞虱成虫体内的表达模式。【结果】geN orm软件分析结果表明,热胁迫后褐飞虱内参基因稳定性在雌虫体内为:β-actin1=β-actin328S rRNAα-2-tubulin18S rRNAβ-actin2;在雄虫体内为:β-actin1=β-actin3α-2-tubulin28S rRNA18S rRNAβ-actin2。BestK eeper软件分析结果显示,在热胁迫的雌、雄虫体内β-actin1均最稳定,18S rRNA次之,β-actin2最不稳定。两种软件分析结果基本一致。以β-actin1为校正内参基因,荧光定量PCR分析hsp70和hsp90在不同热胁迫条件下的表达模式,结果表明,各高温处理下hsp70表达量与对照26℃下的表达量没有显著性差异;而hsp90基因表达模式表现为被高温诱导上调表达,在雌、雄虫体内表达量达到最高的处理条件分别为40℃和38℃处理2 h。【结论】β-actin1基因可以作为热胁迫下褐飞虱雌雄虫体内基因表达模式分析的校正内参基因使用。褐飞虱hsp90基因能被高温诱导表达,该基因可能在褐飞虱适应热胁迫过程中起着重要的作用。     

龙眼体细胞胚胎发生过程中DlWUS的克隆与表达分析

以龙眼‘红核子’LC2悬浮细胞系诱导的胚性愈伤组织为基本材料,按照龙眼体细胞胚胎同步化方法诱导获得龙眼体胚不同阶段材料,并以龙眼体细胞胚胎发生不同阶段混合材料作为试验材料,采用RT-PCR结合RACE技术分离并克隆龙眼中编码同源异型结构域蛋白的转录因子WUSCHEL(简称DlWUS)的cDNA全长及DNA序列,并进行序列分析与表达分析。结果表明:DlWUS的cDNA全长1 110bp,开放阅读框(ORF)858bp,共编码285个氨基酸(GenBank登录号为KM017506),DlWUS的DNA包含2个内含子。序列分析表明,DlWUS是一个不稳定的亲水蛋白,不含信号肽,亚细胞定位于细胞核,具跨膜结构和Homeodomain超级家族的保守结构域以及WUS转录因子家族特有的WUS box和EAR-like结构域,推测该目的基因确实为WUS转录因子。系统进化分析显示,龙眼DlWUS与脐橙WUS归为一个分支,亲缘关系较近。实时荧光定量PCR分析结果表明,在龙眼体细胞胚胎发生整个过程中,DlWUS均有表达,但仅在球形胚时期表达量较高,说明DlWUS可能主要在球形胚阶段发挥作用,并且在一定浓度范围内,外源施加IAA和GA3能够促进DlWUS基因的表达,而外源施加SA则抑制DlWUS基因的表达。     

潮霉素B抗性为选择标记的整合型表达载体的构建及在米根霉中的遗传转化

为了建立适合米根霉的遗传转化体系,应用重叠延伸PCR的方法构建了以潮霉素B抗性为选择标记的单交换整合型表达载体p BS-hygro-ldh A;分别采用PEG/Ca Cl2介导的原生质体转化、原生质体电转化及萌发孢子电转化的方法将表达载体p BS-hygro-ldh A转化入米根霉AS 3.819菌株中,并研究了菌丝酶解时间、孢子萌发时间以及电转化电场强度对于转化效率的影响;通过荧光定量PCR(q PCR)对米根霉转化子基因组中质粒整合拷贝数进行了检测,并研究了其对米根霉转化子抗性稳定性的影响。实验结果表明成功获得整合了表达载体p BS-hygro-ldh A的米根霉转化子。菌丝酶解140 min产生的原生质体其再生率和转化率最高,原生质体电转化最佳电场强度为13 k V/cm,孢子萌发2.5 h转化率最高,萌发孢子电转化最佳电场强度为14 k V/cm。萌发孢子电转化方法转化率要高于原生质体转化的方法。荧光定量PCR检测结果表明,在一定范围内,高质粒整合拷贝数的米根霉转化子比较稳定。研究建立了用于工业米根霉菌株的遗传转化体系,为米根霉代谢调控研究以及菌种改造工作提供了基础与支持。     

不同低温胁迫下草莓叶片FaGR基因表达分析

为进一步探明草莓谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase,GR)基因在低温胁迫下的表达调控模式,以揭示其作用机理和抗逆机制,该研究以草莓栽培品种‘丰香’植株为对象,分别用0、2、4、6、8、10℃低温胁迫以及室温(25℃)作为对照处理24h,从处理植株的新鲜幼嫩叶片中提取总RNA并反转录成cDNA,采用半定量PCR及荧光定量PCR两种定量方法,分析FaGR基因在不同低温胁迫下的表达差异。结果表明:半定量PCR方法与荧光定量PCR方法的结果基本一致。FaGR的相对表达量受到不同低温胁迫和不同程度的诱导,在8℃和10℃低温胁迫下表达量上调,均高于对照水平,且在8℃低温胁迫下相对表达量最高;当温度为6℃时,FaGR表达量急剧下降,当温度低于6℃时,FaGR表达量随着温度的降低而逐渐降低,并低于对照水平;在0℃相对表达量时降至最低水平,约为最大表达量的一半。这说明半定量PCR结果准确可靠,可广泛应用于基因表达研究,而且FaGR表达量受到低温诱导,但不同低温处理对FaGR的表达量诱导程度不同。FaGR相对表达量在一定范围内的低温胁迫下增加,但在此低温范围外的低温胁迫下则降低,该研究表明6℃低温为临界值。以上结果为进一步调控该基因表达提供了科学依据,同时为提高植物抗逆能力提供了基础资料。