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41.
目的:构建葡萄糖6磷酸脱氢酶(Glucose 6-phosphate dehydrogenase,G6PD)T279A和T279S两种突变子.方法:以Genbank No X03674为参考序列设计并合成引物、以含G6PD基因的质粒(Philip JMason博士惠赠)为模板,PCR扩增获得G6PD野生型基因片段,琼脂糖凝胶电泳后回收PCR产物,连接、转化构建克隆质粒pMD18T-G6PD;酶切pMD18T-G6PD质粒、电泳后回收目的基因片段,连接、转化构建含G6PD野生型基因的重组质粒pAL-G6PD;设计并合成含有突变序列的引物,以pAL-G6PD为模板,体外扩增获得G6PD835-海口(835A→G,T279A)和835-中国-1(835 A→T,T279S)突变子.结果:酶切后经电泳鉴定表明获得与预期大小相符的pMD18T-G6PD质粒,EcoRI和Hind Ⅲ双酶切获得与预期大小相符的pAL-G6PD,测序结果与参考序列完全一致.0.8%的琼脂糖凝胶电泳鉴定,并定量pAL-G6PD单链DNA浓度约为200ng/uL.经测序鉴定并与参考序列比对结果表明获得了G6PD的T279A和T279S两种突变子.结论:成功构建了G6PD的T279A和T279S两种突变子,为下一步原核表达、生化性质以及酶动力学等研究奠定了基础.  相似文献   
42.
碱裂解法提取重组质粒DNA及PCR验证   总被引:1,自引:0,他引:1  
目的:筛选获得高质量质粒,为进一步克隆、测序奠定基础.方法:采用常规的碱裂解法从大肠杆菌重组质粒中提取质粒DNA,核酸检测仪测定提取质粒DNA产量和纯度,并用前期DDRT-PCR时采用的引物进行PCR验证性实验,琼脂糖凝胶电泳检测,并对电泳图谱加以分析和鉴定.结果:利用常规的碱裂解法提取重组质粒,通过酚和氯仿的抽提,可以有效地去除蛋白质杂质,用含有Rnase抑制剂的无菌水溶解质粒提取效果最好,得到的质粒DNA无RNA污染,纯度比较高,OD260/OD280比值介于1.8~2.0之间,OD260/OD230比值大于2.0,经PCR反应验证后与预计相符.结论:通过该方法获得的重组质粒纯度和浓度都比较高,且PCR验证与预计相一致,可以满足后续分子生物学实验的要求.  相似文献   
43.
采用酚氯仿抽提法、CTAB法和SDS-蛋白酶K法分别对鱼类病原菌柱状黄杆菌提取基因组DNA。使用超微量紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测所提取的基因组DNA的产量和质量,并用PCR扩增对DNA进行了评价。结果显示,3种方法均可提取到柱状黄杆菌的基因组DNA,并能有效扩增细菌16S rDNA序列,但CTAB法提取的DNA产量和质量最高,CTAB法可以作为柱状黄杆菌DNA提取以开展分子生物学研究的首选方法。  相似文献   
44.
以国产琼脂糖介质为原料,合成了含肼琼脂糖介质。抗体Fc段的糖基经氧化后,可与此种含肼琼脂糖介质偶联,制成高亲和率的免疫亲和层析介质。与溴化氰法相比,这种对抗体上的糖特异的偶联方法制成的免疫亲和层析介质,容量高、稳定性强。用这种含肼琼脂糖介质分别与肿瘤坏死因子和γ-干扰素等的抗体偶联,制成的免疫亲和层析介质可用于分离纯化相应的基因工程产物抗原。  相似文献   
45.
以32份马铃薯或番茄晚疫病菌基因组DNA为模板,分析了琼脂糖凝胶电泳法和聚丙烯酰胺凝胶电泳法对10对SSR引物多态性检测的影响,同时比较了聚丙烯酰胺凝胶电泳两种银染法(常规银染法和快速银染法)的差异。结果显示,聚丙烯酰胺凝胶电泳较琼脂糖凝胶电泳分离效果好,具有更高的多态性检出率,其中快速银染法与常规银染法的检出结果相同,但常规银染步骤繁琐,整个过程要用1-2h,而快速银染只需约15min,且染色背景较浅,条带清晰。聚类分析显示,聚丙烯酰胺凝胶电泳快速银染法可将供试晚疫病菌株分布于更多的聚类组,显示出更高的遗传变异度。可见,聚丙烯酰胺凝胶电泳快速银染法结合SSR分子标记技术,可有效地用于马铃薯或番茄晚疫病菌群体遗传多样性分析。  相似文献   
46.
目的:提高重组质粒的筛选效率,探讨一种经济、快速并准确的重组质粒鉴定方法。方法:取200μl菌液于Eppendorf管中高速离心1min,倒出上清,沉淀中加入20μl裂解缓冲液以裂解细胞并释放出内部质粒,10000r/min离心10min后取5~10μl上清液进行琼脂糖凝胶电泳,并比较其迁移位置来以判断重组质粒。结果:该方法鉴定结果和PCR鉴定结果完全一致。结论:该方法具有成本低廉、简便快速的特点,在对大量样品进行鉴定时具明显优势,适合在常规实验室推广。  相似文献   
47.
由于某些原因,(例如,用Maxam—Gibert方法测定序列;与低含量RNA杂交。)有时需要获得双链相互分离的DNA分予片断。通常采用的方法是让变性的DNA在中性琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。许多DNA片断的两条互补链在凝胶中有不同的迁移率,其原因尚不清楚。  相似文献   
48.
本文报道了低PH值注丙球IgG含量测定免疫单扩散法的建立,并对其影响因素进行了初步试验。结果表明,试验方法较为稳定,简单易行。在低PH静注丙球IgG含量检测时,进口Sigma琼脂糖效果优于国产琼脂糖(P〈0.01),国产(东海)琼脂糖不适于IgG含量的定量检测;应先将静注丙球PH调至中性后进行IgG含量测定(P〈0.05)样品中含有的10%麦芽糖对试验结果无影响(P〉0.05)。  相似文献   
49.
50.
孙伟明  郭巍  刘大群 《微生物学报》2008,48(12):1671-1674
【目的】建立一种高效检测和分析玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63内源质粒的方法。【方法】根据“链霉菌线性质粒5′末端都结合有共价蛋白”这一性质,通过改进琼脂糖包埋块制作方法,发明了一项快速高效检测链霉菌质粒种类、构型及大小的技术,称为“包埋块二次处理法”,该方法还能从正反两方面表明共价蛋白的存在与否。【结果】利用此方法高效检测出了玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63中存在两种线性质粒,双向电泳验证了该方法的正确性,推测质粒大小分别约为 47 kb和53 kb。【结论】利用本研究发明的方法首次成功地检测了玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63中的内源线性质粒。  相似文献   
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