N末端亲和标签可增进人硫氧还蛋白-1对氧化剂的敏感性

人细胞质硫氧还蛋白(hTrx1)在抗氧化和氧化还原调控中起重要作用.如果静脉注射重组hTrx1,动物抗氧化能力将增高.近年来,随着人们对氧化还原调控的关注,hTrx1需求不断增加.为了快速获得高纯度重组hTrx1,N末端亲和标签,如组氨酸标签(His-tag)和谷胱甘肽S-转移酶标签(GST-tag),被用于hTrx1亲和纯化.带N末端标签的hTrx1融合蛋白在实验中用的越来越多.但N末端延长是否会影响hTrx1特性尚不清楚.我们构建与优化了hTrx1原核表达质粒,在大肠杆菌中高效表达了含天然N末端、带His-tag或带GST-tag的3种重组hTrx1.纯化蛋白在SDS-PAGE上呈现1条带,对应的分子量分别为12kD、17kD及38kD.在无氧化剂存在时,它们催化胰岛素还原的能力不分仲伯.当有H2O2存在时,天然N末端hTrx1通过形成可逆二聚体,对H2O2表现出较强的耐受性;而N末端亲和标签有干扰二聚体形成,使hTrx1对H2O2耐受性降低的作用,其中GST-tag干扰作用明显大于His-tag.此外,体内重要的氧化还原对GSH/GSSG,有增进hTrx1及其还原酶催化NADPH氧化的作用,N末端亲和标签可明显扩大GSH/GSSG的这种作用.我们分析了N末端亲和标签对hTrx1活性影响的可能机理.     

氟康唑对热带念珠菌活性氧和线粒体膜电位的影响

为了探讨氟康唑作用机制,观察它对热带念珠菌作用后存活率、活性氧(Reactive oxygen species,ROS)、线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential,△Ψm)和细胞周期的变化。参照NCCLS M27-A方案的微量稀释法测定氟康唑对热带念珠菌的最低抑菌浓度(MIC);热带念珠菌与不同浓度氟康唑共同培养后用流式细胞术(Flow cytometry,FCM)分析热带念珠菌存活率、ROS、线粒体膜电位△Ψm和细胞周期的变化。结果表明,氟康唑作用后,热带念珠菌氟康唑耐药株的存活率、ROS、线粒体膜电位△Ψm和细胞周期各期比例均没有明显变化;而热带念珠菌氟康唑敏感株的存活率和线粒体膜电位△Ψm明显下降,ROS明显升高,而且大部分热带念珠菌阻滞于G2/M期,并出现明显凋亡峰,呈一定的时间剂量依赖关系。自由基清除剂谷胱甘肽抑制热带念珠菌ROS的产生,阻止细胞周期G2/M期阻滞和降低凋亡。由此可见,氟康唑可能通过刺激热带念珠菌产生过多ROS,并使线粒体膜电位△Ψm下降,从而诱导热带念珠菌凋亡。     

基于Oncomine数据库探究COL1A1基因在胰腺癌中的表达及意义

[目的]探究COL1A1基因在胰腺癌中的表达及临床意义。[方法]收集Oncomine和NCBI/GEO Profiles数据库中关于COL1A1的信息,对目前数据库中资料再次进行分析,并对其在胰腺癌组织和正常胰腺组织中的表达进行荟萃分析,使用Kaplan-Meier Plotter在线数据库分析该基因是否与胰腺癌患者的预后相关。[结果]Oncomine数据库中共收集了400项不同类型的研究。其中COL1A1高表达有86项研究,低表达有6项研究。共有8项研究涉及COL1A1在胰腺癌组织与正常组织中的表达,包括209例样本,与正常组织相比,COL1A1在胰腺癌组织中高表达(P<0.05)。NCBI/GEO Profiles数据库分析发现TGF-β处理48 h后COL1A1表达升高。Kaplan-Meier Plotter数据库分析表明COL1A1高、低表达组胰腺癌患者的总体生存率(OS)无统计学差异(HR=1.4,95%CI:0.92~2.12,P=0.11),但高表达组胰腺癌患者的无复发生存(RFS)明显差于低表达组(HR=5.05,95%CI:1.48~17.24,P=0.0044)。[结论]COL1A1基因在胰腺癌组织中的表达明显高于正常组织,低表达患者的RFS延长。可见靶向COL1A1的药物有望改善胰腺癌患者的预后。     

动物基因组编辑中提升CRISPR/Cas9介导的同源重组效率研究进展*

基因组编辑技术可以对DNA或RNA进行精准改造,极大地促进了生命科学的发展。CRISPR/Cas9系统在靶位点诱导DNA发生双链或单链损伤,细胞对损伤部位采用无供体模板的非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)或有供体模板的同源重组(homologous recombination,HR)修复。基于HR的基因组编辑策略通常被用于获得DNA的精准改造,而NHEJ在动物DNA损伤修复中起主导作用。为了提升HR效率,研究人员设计了多种方案,包括CRISPR/Cas9系统优化和DNA修复通路调控等。从DNA损伤修复途径、Cas9变体选择、sgRNA设计、供体模板设计、DNA修复途径相关蛋白功能调控、供体模板募集效率提升、细胞周期调控及编辑细胞生存效率提升等方面详细综述了相关研究成果,发现尚未开发出放之四海而皆准的HR提升策略,基于HR的基因组编辑需要针对具体案例制定个体化策略。旨在为动物基因组编辑中提升CRISPR/Cas9介导的HR效率研究提供理论参考,为动物基因功能分析、基因治疗和经济动物基因编辑育种提供帮助。     

高效液相色谱法分离和鉴定腐马素B_1

腐马素是由串珠镰刀菌产生的真菌毒素,其中腐马素B1可引发马脑白质软化症等疾病。本文用高效液相色谱法从串珠镰刀菌玉米培养物中分离出了腐马素B1并通过紫外光谱和快原子轰击质谱进行了鉴定。     

新生期反复惊厥对认知和海马CaMKⅡ表达的远期影响及干预研究

新生期惊厥活动可造成严重的神经后遗症,如成年期大脑对惊厥的易感和易损性提高,严重者产生认知功能损害.对发育期惊厥性脑损伤远期预后的研究,尤其是分子机制及其干预的研究具有重要的临床意义.探讨了新生期大鼠单次长程或反复惊厥对学习、记忆能力和海马突触后致密物质钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)表达的远期影响及运动训练的干预作用.生后6天(P6)的SD大鼠随机分成单次长程惊厥组(SS)、反复惊厥组(RS)和对照组,每组12只.3组大鼠分别于P27～P31、P58～P61、P80～P82采用Morris水迷宫检测学习、记忆功能.P51～P56对SS组和RS组进行踏转轮训练.最后脑组织切片观察CaMKⅡmRNA在海马的表达.结果显示,第一次Morris水迷宫测试RS组第1天～第4天潜伏期明显高于对照组,具有显著性差异(P＜0.05),第二次水迷宫RS组第1天～第2天的逃避潜伏期较对照组仍显著延长,具有显著性差异(P＜0.05),第三次测试各组之间差异无统计学意义.搜寻策略显示,在第一次Morris测试时RS组第3天～第4天边缘式搜寻比例明显高于对照组,具有显著性差异(P＜0.01),同时RS组第3天～第4天趋向式搜寻比例明显低于对照组,具有显著性差异(P＜0.01),而第二次和第三次水迷宫测试3组间趋向式和直线式搜寻策略无明显差异.在记忆实验中,原平台象限游泳距离与总距离的比值,RS组第三次较对照组显著降低,有统计学意义(P＜0.05);另外RS组1～3天趋向式搜寻比例均明显低于对照组,有显著性差异(P＜0.05).CaMKⅡ原位杂交显示,各组CaMKⅡmRNA在海马均有明显表达,但是在齿状回和门区RS组表达明显低于对照组,具有统计学意义(P＜0.01).研究表明,新生期反复长程惊厥能够对学习和记忆功能产生远期的损害,可能与海马记忆分子CaMKⅡ表达下调有关,而单次长程惊厥对学习记忆无明显影响.早期运动训练能够明显改善反复惊厥所致的学习能力损害,但对记忆能力效果仍较差.     

北京地区不同地形条件下的土地覆盖动态

利用MSS/TM影像和1∶250 000 高程数据分析了1978~2001年北京地区土地覆盖的变化。为研究人类活动对土地覆盖类型及植被变化的影响,根据植被的分布规律和人类活动影响,利用数字高程模型(DEM)将研究区遥感影像分为不同海拔段,分别建立标志进行解译。通过转移概率矩阵计算、不同地形因子影响下的土地覆盖类型分布的GIS分析,得到如下结果:1) 1978~2001年间北京市土地覆盖变化主要发生在平原和低海拔、小坡度的平缓地区,表现为农业用地向城镇用地的转变;高海拔地区主要为天然植被所覆盖,土地覆盖变化相对较小,主要是灌丛向林地的转变。2) 地形因子显著影响土地覆盖类型的分布及变化。随着海拔的升高和坡度的增大,农业用地和城镇用地减少,林地和灌丛逐渐增加。坡向对植被的分布也有较大影响。     

基于1H-NMR及GC-MS的中国块菌及其共生云南松的代谢物分析

采用代谢组学技术研究中国块菌(云南黑松露)及其共生云南松的小分子活性代谢产物.运用核磁共振(1H-NMR)和气相质谱(GC-MS)两种技术,分析新鲜中国块菌成熟子实体及松根的代谢成分;将1H-NMR及GC-MS数据导入SMICA-P软件进行多元统计分析,比较二者的差异代谢物.在块菌子实体及松根中分别共检测到了苏氨酸、甘...     

三种淋巴瘤细胞CD52抗原呈现稳定性研究及其应用

评估淋巴瘤细胞MC/CAR、HUT78和RAMOS的CD52抗原呈现稳定性,并比较三种细胞用于抗CD52单抗活性检测中的优劣性。采用免疫荧光法检测淋巴瘤细胞MC/CAR、HUT78和RAMOS的CD52抗原呈现率,分析MC/CAR、HUT78和RAMOS传代培养5~20代CD52抗原呈现稳定性。分别以MC/CAR、HUT78和RAMOS作为抗CD52单抗结合活性和补体依赖细胞毒性的靶细胞进行检测,并比较其优劣性。结果显示,MC/CAR、RAMOS和HUT78的CD52抗原呈现率分别为95.5%、63.2%和38.3%。MC/CAR传代培养5~20代CD52抗原呈现率均大于90%。RAMOS传代培养5~13代CD52抗原呈现率介于60%~67%,第14~15代CD52抗原呈现率介于50%~60%,第16~20代细胞CD52抗原呈现率介于40%~50%。HUT78传代培养5~20代CD52抗原呈现率介于26.7%~38.9%。淋巴瘤细胞MC/CAR在抗CD52单抗的结合活性检测中呈现出更好的剂量依赖曲线。淋巴瘤细胞RAMOS在抗CD52单抗的补体依赖细胞毒性检测中呈现出更好的剂量效应曲线。CD52抗原呈现率方面MC/CAR>RAMOS>HUT78。结果表明,MC/CAR更适用于抗CD52单抗的结合活性的检测,RAMOS适用于抗CD52单抗的补体依赖细胞毒性检测。     

抗肿瘤血管三结构域单链抗体VH/L的构建与表达

以本室研制的一株抗肿瘤血管单克隆抗体AA98为基础,采用PCR扩增抗体AA98基因的重链可变区(V_H)和轻链(L),以重链恒定区1(C_H1)5′端12个氨基酸的序列作为连接肽,并将连接肽中的Lys突变为Ser,构建VH连接肽-L三结构域单链抗体。重组VH/L单链抗体在大肠杆菌中得到了高效表达,其表达量占菌体总蛋白质的20%。表达的蛋白质在菌内形成包含体,经凝胶过滤法复性,获得了有抗原结合活性的V_H/L。该三结构域单链抗体的成功构建和复性,为重组抗体片段的研制提供了借鉴。