医学真菌基因组学研究进展(上)

近年来,一系列重要医学致病真菌全基因组数据陆续被公布,使人类对这些致病菌的认识提高到全新水平.本文在回溯医学真菌基因组学和基因组测序技术发展历程、综述其发展现状及应用的基础上,再分别介绍重要医学真菌全基因组测序的进展.     

高产莫纳可林K低产桔霉素红曲霉菌株的筛选和发酵条件初步优化

采集全国各地红曲霉制品中的红曲霉资源,经分离获278株红曲霉菌株。高效液相色谱(HPLC)法测定各菌株发酵液中莫纳可林K(Monacolin K)和桔霉素含量,筛选获1株Monacolin K产量较高、桔霉素含量较低的红曲霉菌株编号为M-22。依据形态特征和ITS基因序列,参照红曲霉属分类检索表,鉴定M-22菌株为紫色红曲霉(Monascus purpureus)。通过摇瓶发酵对温度、初始pH、碳源、氮源、碳氮比(C/N)等因素进行优化,确定M-22菌株摇瓶发酵产Monacolin K适宜条件为发酵温度26℃、初始pH 5.0、转速160 r/min,甘油为碳源、蛋白胨为氮源、碳氮比(C/N)为5:1,Monacolin K产量显著提高,最高为107.16 mg/L。以优化的发酵条件对M-22菌株进行5 L发酵罐发酵,发酵液中Monacolin K产量最高为189.83 mg/L,桔霉素含量32.53μg/L,红曲色素色价为16.38 U/m L。     

蝙蝠蛾拟青霉发酵滤液的成分组成与急性毒性分析

蝙蝠蛾拟青霉是从新鲜的冬虫夏草上分离获得的虫草菌,可采用生物发酵制备大量菌丝体。该菌丝体具有和冬虫夏草相似的活性成分,具有抗肿瘤、抗病毒等多种功效。本研究对干燥后的蝙蝠蛾拟青霉发酵滤液的主要成分进行了分析,结果显示：干燥后的蝙蝠蛾拟青霉发酵滤液含粗脂肪21.33%,总蛋白27.34%,水解氨基酸16.79%,粗多糖11.16%,不饱和脂肪酸71.21%,其中以油酸、亚油酸为主;该干燥发酵滤液中还含有多种核苷类物质、多糖等生物活性成分以及多种人体必需的矿质元素。此外急性毒性实验的初步结果表明：小鼠在实验期内无死亡现象和明显的中毒反应,主要脏器的形态学正常;谷草转氨酶（AST）和谷丙转氨酶（ALT）活性与对照组相比无统计学差异。蝙蝠蛾拟青霉发酵滤液有望在医药和保健领域进一步研究开发。     

假单胞菌YL11对扩展青霉的抑制作用及其机理初探

【背景】苹果青霉病是由扩展青霉引起的一种重要的果实采后病害,影响果实品质导致苹果腐烂从而造成经济损失。【目的】研究假单胞菌YL11对扩展青霉的抑制作用和苹果采后青霉病的防治效果,并对抑菌机理进行初步探讨。【方法】以扩展青霉为供试菌株,研究不同浓度的假单胞菌YL11无菌发酵液对扩展青霉菌落直径、孢子萌发率、菌丝体干重、苹果损伤接种病斑直径扩展的影响,利用对电导率、核酸及蛋白释放量、AKP含量、SDH活性、ATP酶活性和ATP含量的影响对抑菌机理进行探究。【结果】假单胞菌YL11无菌发酵液能有效抑制扩展青霉生长,抑菌圈直径为22.33±0.27 mm,抑菌效价为71.67 mm/mL;能有效抑制孢子萌发,100%无菌发酵液对孢子萌发抑制率达到80.2%;对扩展青霉的生物量也有一定抑制作用,体积分数为100%时,菌丝体干重为4.7mg/mL,抑制率达到39.74%;无菌发酵液处理能有效抑制苹果青霉病病斑的扩展,3d时对病斑扩展的抑制率最大,达到47.1%;无菌发酵液处理均能引起电导率升高、胞内核酸和蛋白释放量增大、胞外AKP含量升高、SDH活性降低、ATP酶活性和ATP含量均降低,且随着发酵液浓度的增加效果越明显。【结论】假单胞菌YL11能显著抑制扩展青霉的生长,破坏细胞膜结构、降低能量代谢酶活性,从而扰乱扩展青霉的正常生长,对苹果青霉病有较好的生防效果,具有潜在的开发价值。     

宛氏拟青霉菌木聚糖酶的分离纯化

经自然筛选分离得到一株产高木聚糖酶活力的拟青霉属菌,初步鉴定为宛氏拟于霉（ＰａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓｖａｒｉｏｔｉＢａｉｎｉｅｒ）菌。该菌所产的木聚糖粗酶液分别经硫酸铵,乙醇沉淀,ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１００,ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｄｅｘＡ－５０分离纯化后得４个组分,分别称为Ｉ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ。其反应最适温度和ｐＨ分别为Ｉ,ｐＨ４．２,４７℃,Ⅱ,ｐＨ４．２,５２℃,ⅢｐＨ４．０,４７℃,Ⅳ,ｐＨ３．８,４     

淡紫拟青霉在大豆根际的定殖及对根际微生物的影响

温室实验证明淡紫拟青霉M－14菌株发酵液对大豆种子包衣,无菌土中种植1周后有1／10的生防菌能够在大豆根际定殖,其中内根际（根表与根内）可检测到菌剂包衣量的1／1000．第2周时内根际菌量提高10倍以上,4周后有所下降。2％NaClO表面消毒后,检测出植物根内也有少量淡紫拟青霉存在。大豆胞囊线虫感病土中,该菌3周后开始大量增殖。病土中引入菌剂,1周后根际其它各种微生物数量略有减少,真菌、细菌、放线菌分别减少16％、27％和27％,4周时均达到平衡,与对照一致。     

淡紫拟青霉胞外多糖的分离、纯化及结构分析

淡紫拟青霉NH-PL-03菌株的胞外多糖粗提物对枯萎病病原菌-尖孢镰刀菌具有较好的抑制效果,文中对淡紫拟青霉胞外多糖进行了分离纯化和结构分析,以期为其构效关系研究奠定基础。采用乙醇沉淀法从淡紫拟青霉发酵液中提取粗多糖,经Sevage法脱蛋白后,过Superdex-G75凝胶层析柱分离得到胞外多糖EP-1。紫外分光法和Sephacryl S-200 HR凝胶层析柱检测EP-1为均一多糖,Sephacryl S-200柱层析测得EP-1的分子量为35.2 kDa,完全酸水解后纸层析检测EP-1的单糖组成中仅有葡萄糖,红外光谱、高碘酸氧化和Smith降解结果表明EP-1的化学结构是以β-(1,3)糖苷键连接而成的无分枝的葡聚糖。刚果红络合试验表明EP-1在稀的碱溶液中以3股螺旋构象存在。     

胁迫条件对一土生青霉菌总酚积累及其清除自由基能力的影响

旨在阐明胁迫条件对一土生青霉菌总酚积累及其抗氧化活性的影响。采用固体培养基培养青霉菌,以紫外线辐射、添加H2O2水溶液和降低培养基营养物质含量作为胁迫手段,检测受到胁迫后,菌体总酚的积累及酚类清除自由基的能力。菌丝体总酚含量以Folin-Ciocalteu法测定,自由基清除率以分光光度法测定。结果表明,在胁迫条件下,各实验组菌丝体的总酚含量较对照组均有显著提高,添加H2O2组的总酚含量最高达63.86mg/g,紫外线辐射组的总酚含量最高达58.4mg/g,营养胁迫组的总酚含量最高达43.19mg/g。各实验组酚类提取物对羟自由基的清除率最高,其中添加1mmol/LH2O2组为35.28%,紫外线辐射40s组为69.97%,75%营养胁迫组为50.83%。因此,胁迫条件可增加该青霉合成酚类化合物及提高其抵抗胁迫的能力。     

近岸污染指示半知菌灰黄青霉(Penicillium griseo fulvum)的分子检测

【目的】通过分子方法检测近海污染环境优势种灰黄青霉,并为由此而推断污染程度做准备。【方法】根据GenBank中青霉属不同种和相近属种的ITS序列差异和灰黄青霉特有的IAO序列,设计了污染区优势种灰黄青霉的特异性引物AS1/RS4和IAO1/IAO2,建立相应的特异探针检测体系。通过PCR和套式PCR技术,分析比较两对特异序列检测灰黄青霉的差异。【结果】建立的分子检测体系可以排除其它近似或相关菌株干扰,从环境中扩增到目的基因片段。利用引物AS1/RS4作为核酸探针,通过套式PCR菌株DNA的检测灵敏度可达到10fg/μL,当仅有10个数量级分生孢子时即可检测出,从沉积物中检测灵敏度为102个数量级孢子/0.25g。特异酶基因IAO1/IAO2检测灵敏度较前者稍低。【结论】利用特异序列作为探针检测污染环境优势种灰黄青霉的方法可行,在一定范围内,灰黄青霉的出现频率及数量对污染程度有较好的指示作用。     

一株多花黄精内生真菌的鉴别及其抗菌代谢产物

【目的】药用植物内生真菌是一类重要的微生物资源,能代谢产生多种生物活性物质。本研究从浙江庆元百山祖自然保护区多花黄精(Polygonatum cyrtonema)分离获得1株具有抗菌活性的菌株zjqy610。【方法】通过形态和ITS rDNA序列分析,鉴定为变灰青霉(Penicillium canescens)。采用正相硅胶柱层析和凝胶(Sephadex LH-20)柱层析,以紫外光或碘蒸汽显迹,配合活性追踪等,从zjqy610发酵液中分离获得3个具抗真菌活性的化合物。【结果】通过质谱和核磁共振波谱技术分别将其结构鉴定为:乙基氧苯氨基亚胺乙酸(o-acetylbenzeneamidinocarboxylic acid)、灰黄霉素(griseofulvin)和[1,2-b]呋喃2-甲基3-羧甲基4-羟基-5-甲氧基萘(naphtho[1,2-b]furan-3-carboxylic acid,4-hydroxy-5-methoxy-2-methyl-)。抑菌活性测试表明,3个化合物对多种植物病原真菌具有抑制活性,其中化合物zjqy610D-4对番茄灰葡萄孢、圆形炭疽菌、泻根亚隔孢壳和核盘菌4种病原真菌的活性最强,半抑制浓度EC50分别为0.68、0.38、0.91和0.61mg/L。【结论】该化合物具有开发成农用抗生素的价值。