脊髓组织内微血管过氧化物酶组织化学染色方法的实验研究

本文以正常及损伤脊髓组织为材料,对内源性过氧化物酶染色显示微血管的方法进行了实验研究。结果,组织用10％缓冲福尔马林4℃固定6—12小时,或微波固定40～120秒,冰冻切片30～50μm、DAB-NiCl显示血管最好。该方法不用灌注,对血管无扩张、破裂作用,无人为改变,可以定量或半定量判定组织器官活体时的血液循环,可用于正常及损伤脊髓组织内微血管形态学研究和定量分析。     

miR-20b-5p靶向MAPK1调控脑出血过程中脑微血管内皮细胞铁死亡

摘要 目的：探讨miR-20b-5p对氧糖剥夺（OGD）/Hemin处理的脑微血管内皮细胞（BMVEC）功能的影响及机制。方法：将BMVEC分为Control组、agomir-NC组、agomir-miR-20b-5p组、antagomir-NC组和antagomir-miR-20b-5p组。使用Lipofectamine 2000试剂对细胞进行相应的转染处理。BMVEC转染后,将BMVEC再分为Control组、OGD/Hemin组（O/H组）、OGD/Hemin+agomir-NC组（O/H+agomir-NC组）、OGD/Hemin+agomir-miR-20b-5p组（O/H+agomir-miR-20b-5p组）、OGD/Hemin+antagomir-NC组（O/H+antagomir-NC组）和OGD/Hemin+antagomir-miR-20b-5p组（O/H+antagomir-miR-20b-5p组）。Control组BMVEC正常培养,其他组BMVEC进行OGD/Hemin处理。MTT法检测BMVEC增殖,TUNEL染色检测BMVEC凋亡,Transwell检测BMVEC迁移。使用试剂盒检测超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和丙二醛（MDA）水平。使用Iron Assay试剂盒检测Fe²⁺含量。通过qRT-PCR检测miR-20b-5p和MAPK1 mRNA水平。通过Western blot检测MAPK1、Bax、Bcl-2、谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）和前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）蛋白表达水平。通过免疫荧光染色检测MAPK1的荧光强度水平。结果：与Control组和agomir-NC组比较,agomir-miR-20b-5p组BMVEC中的miR-20b-5p水平升高（P<0.05）。与Control组和antagomir-NC组比较,antagomir-miR-20b-5p组BMVEC中的miR-20b-5p水平降低（P<0.05）。与Control组比较,O/H组BMVEC中的miR-20b-5p水平降低,细胞活力降低,TUNEL阳性率和Bax蛋白表达水平升高,Bcl-2蛋白表达水平降低,迁移数量降低,SOD和GSH-Px活性降低,MDA含量升高,Fe²⁺含量和PTGS2的蛋白表达水平升高,GPX4的蛋白表达水平降低,MAPK1的mRNA和蛋白表达水平以及相对荧光强度升高（P<0.05）。与O/H组和O/H+agomir-NC组比较,O/H+agomir-miR-20b-5p组BMVEC中的miR-20b-5p水平升高,细胞活力升高,TUNEL阳性率和Bax蛋白表达水平降低,Bcl-2蛋白表达水平升高,迁移数量升高,SOD和GSH-Px活性升高,MDA含量降低,Fe²⁺含量和PTGS2的蛋白表达水平降低,GPX4的蛋白表达水平升高,MAPK1的mRNA和蛋白表达水平以及相对荧光强度降低（P<0.05）。与O/H组和O/H+antagomir-NC组比较,O/H+antagomir-miR-20b-5p组BMVEC中的miR-20b-5p水平降低,细胞活力降低,TUNEL阳性率和Bax蛋白表达水平升高,Bcl-2蛋白表达水平降低,迁移数量降低,SOD和GSH-Px活性降低,MDA含量升高,Fe²⁺含量和PTGS2的蛋白表达水平升高,GPX4的蛋白表达水平降低,MAPK1的mRNA和蛋白表达水平以及相对荧光强度升高（P<0.05）。结论：本研究表明上调miR-20b-5p通过抑制OGD/Hemin处理的BMVEC中MAPK1的表达从而抑制了铁死亡途径。     

树鼩视网膜微血管内皮细胞永生化细胞株的建立及鉴定

目的 建立树鼩视网膜来源的微血管内皮细胞的体外分离培养技术以及永生化细胞株,为体外利用树鼩视网膜微血管内皮细胞开展相关研究提供新的实验材料。方法 利用Ⅱ型胶原酶、分散酶和DNaseⅠ酶消化法分离培养出原代视网膜微血管内皮细胞,利用差速消化法纯化内皮细胞,然后利用携带SV40T基因的慢病毒转染细胞,再挑取单克隆后进行传代培养。对传至50代以上的细胞进行形态学观察、免疫荧光鉴定以及核型鉴定。结果 采用混合酶消化法能够分离获得微血管内皮细胞,纯化后的细胞呈不规则多角形和梭形。经慢病毒转染后的细胞传代培养后细胞形态一致,到第50代时细胞形态结构仍较好。细胞免疫荧光结果显示标志性蛋白VWF、CD34、Claudin1、ZO-1和永生化SV40T表达阳性。生长曲线结果显示：细胞生长旺盛,第2～4天时处于对数生长期,第4天进入平台期。细胞核型结果显示：染色体数与树鼩染色体相同,即所获取的细胞为永生化的树鼩视网膜微血管内皮细胞。结论 成功建立的树鼩视网膜微血管内皮细胞永生化细胞株具有较好的形态结构与功能,为视网膜病变及眼科相关疾病的研究提供了新的实验材料。     

胃癌组织中Survivin、P53蛋白表达和微血管密度测定及意义

目的探讨Survivin,P53蛋白在胃癌组织中的表达及其与血管生成的关系。方法用免疫组化方法对65例胃癌组织Survivin,P53,CD34的表达进行检测。结果胃癌组织中Survivin蛋白阳性表达率为70.77%（46/65）,P53蛋白阳性表达率为64.62%（42/65）。Survivin表达与分化程度和淋巴结转移有关（P〈0.05）,而与临床分期无关（P〉0.05）;P53的阳性表达与分化程度、临床分期和淋巴结转移有关（P〈0.05）。Survivin表达与P53的表达密切相关（r=0.413,P〈0.01）。Survivin阳性表达组织中的MVD值为103.04±15.06,阴性组为81.89±12.15,二者有显著差异（P〈0.01）。P53阳性表达胃癌组织中的MVD值为105.83±15.06,阴性组为81±12.71,二者有显著差异（P〈0.01）。结论Survivin和P53突变对凋亡的抑制的协同作用及其促进血管生成的作用在胃癌的发生发展中起关键作用。     

微血管减压术在三叉神经痛患者中的应用及预后分析

目的:分析微血管减压术在三叉神经痛患者中的应用及预后效果。方法:选取2015年8月至2016年7月我院收治的86例三叉神经痛患者,根据患者入院顺序分为观察组43例和对照组43例。对照组予以三叉神经节射频热凝治疗,观察组使用微血管减压术完成治疗。比较两组患者临床疗效,疼痛情况、睡眠情况,生存质量。结果:治疗后,观察组临床总有效率显著高于对照组[93.02%(40/43)比72.09%(31/43)](P0.05)。观察组的视觉模拟评分(VAS)、匹茨堡睡眠质量指数量表评分(PSQI)显著低于对照组[(3.35±0.31)分、(7.02±0.81)分比(5.68±0.57)分、(8.45±0.92)分](P0.05)。观察组的生存质量评分显著高于对照组[(83.43±8.22)分比(68.98±6.51)分](P0.05)。结论:在三叉神经痛患者中经微血管减压术治疗,能降低患者疼痛程度,提高睡眠质量和生存质量,有利于患者预后的改善。     

Stathmin 在微血管内皮细胞的表达与胶质瘤恶性程度关系

目的:检测Stathmin在正常脑组织及不同级别胶质瘤微血管内皮细胞中的表达情况。方法:利用结合CD105单克隆抗体的免疫磁珠内皮细胞分选系统特异性分选出68例胶质瘤微血管内皮细胞(其中低级别胶质瘤(WHO分级Ⅰ-Ⅱ)24例,高级别胶质瘤(WHO分级Ⅲ-Ⅳ)44例)和20例正常脑组织微血管内皮细胞。应用免疫组化、RT-PCR和Western blot检测Stathmin在胶质瘤微血管内皮细胞和正常脑组织微血管内皮细胞中的表达。结果:免疫组化证实Stathmin在正常脑组织微血管内皮细胞、低级别胶质瘤微血管内皮细胞和高级别胶质瘤微血管内皮细胞的表达百分率分别是20%,66%和95%(P<0.05)。RT-PCR和Western blot法检测显示,Stathmin在胶质瘤微血管内皮细胞中的表达明显增高。低级别胶质瘤组、高级别胶质瘤组分别与正常组比较,均有显著性差异(P<0.01);且低级别胶质瘤组与高级别胶质瘤组比较,有显著性差异(P<0.01),随着胶质瘤恶性程度的增加,Stathmin表达上调,具有统计学意义。结论:Stathmin在脑胶质瘤微血管内皮细胞中表达随肿瘤恶性程度增高而增加,可能为脑胶质瘤的生物治疗提供一个新靶点。     

毒力岛基因ibeT有助于大肠杆菌抵抗人脑微血管内皮细胞溶酶体的降解

大肠杆菌是导致新生儿细菌性脑膜炎最常见的革兰氏阴性致病菌．为探讨毒力岛基因ibeT在大肠杆菌K1株致病过程中的作用,构建了ibeT基因缺失的大肠杆菌K1株,细菌在细胞内存活试验结果显示,ibeT基因缺失抑制了大肠杆菌K1株在人脑微血管内皮细胞中的生长．利用激光共聚焦扫描显微镜观察到,在细菌侵袭进入人脑微血管内皮细胞后,与野生型相比,ibeT基因缺失突变株较多地滞留在溶酶体内;透射电镜结果进一步显示,ibeT基因缺失使大肠杆菌K1株逃逸ECV(含有大肠杆菌的囊泡)的能力发生了下降,继而使其在细胞浆内的复制减少．利用体外模拟的弱酸性环境,检测大肠杆菌菌体胞内的缓冲容量,发现ibeT基因缺失突变株菌体胞内的缓冲能力较野生型低．这些结果提示,在大肠杆菌K1株侵袭进入人脑微血管内皮细胞后,ibeT基因有利于大肠杆菌降解ECV膜,避免与溶酶体融合,进而促使大肠杆菌逃逸进入细胞浆并进行复制．     

胃癌乙酰肝素酶和NF-κB表达及与临床病理特征和血管形成的关系

目的探讨胃癌乙酰肝素酶(heparanase,HPA)和激活的NF-κB表达及与胃癌临床病理特征和血管形成的关系。方法免疫组织化学(IHC)分别检测了138例胃癌、138例配对癌旁胃粘膜(距癌2cm)和138例配对远离胃癌的手术切缘正常胃粘膜组织(距癌5cm以上)HPA蛋白的表达;138例胃癌组织NF-κB、血管内皮生长因子(VEGF)和CD34蛋白的表达,CD34抗体进行血管内皮染色,用于计数胃癌组织微血管密度(MVD);人胃癌细胞系SGC-7901和MGC803中HPA蛋白的表达。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测了40例胃癌、40例癌旁胃粘膜(距癌2cm)和40例远离胃癌的手术切缘正常胃粘膜组织(距癌5cm以上)以及人胃癌细胞系SGC-7901和MGC803 HPA mRNA的表达结果胃癌HPA蛋白和mRNA阳性表达率(71.0%,72.5%)明显高于癌旁胃粘膜(32.6%,35.0%)和正常胃粘膜(10.0%,8.8%)(P均<0.01),癌旁胃粘膜明显高于正常胃粘膜(P<0.01)。HPA蛋白和mRNA在人胃癌细胞系SGC-7901均为阳性,而在人胃癌细胞系MGC803均为阴性。胃癌HPA和激活的NF-κB蛋白阳性表达率,侵袭至浆膜外、有脉管内瘤栓、有淋巴结转移、有远端转移和临床分期Ⅲ-Ⅳ期者明显高于侵袭至浆膜、无脉管内瘤栓、无淋巴结转移、无远端转移和临床分期I-Ⅱ者(P均<0.05)。胃癌HPA蛋白表达和激活的NF-κB蛋白表达成正相关(rs=0.223,P=0.009)HPA蛋白表达和激活的NF-κB蛋白表达阳性胃癌的MVD明显高于HPA蛋白表达和激活的NF-κB蛋白表达阴性胃癌的MVD(P均<0.01)。胃癌HPA蛋白表达和激活的NF-κB蛋白表达均与VEGF蛋白表达成正相关(rs=0.275,P=0.001;rs=0.527,P=0.000)。结论HPA和激活的NF-κB蛋白表达在胃癌的发展及血管形成中起重要作用;胃癌HPA蛋白表达与激活的NF-κB蛋白表达有关。     

骨肉瘤中血管生成拟态与HIF-1α蛋白的关系及临床意义

目的检测骨肉瘤中血管生成拟态(vasculogenic mimicry,VM)和缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的关系及临床意义,旨在探寻影响骨肉瘤进展及预后的有效指标。方法采用CD34和PAS套染法检测108例骨肉瘤及28例骨软骨瘤中VM、微血管密度(Microvessel density,MVD)及HIF-1α表达水平差异,并分析其与骨肉瘤患者临床病理因素及5年存活率之间的关系。结果骨肉瘤组织中VM、HIF-1α过表达及MVD≥22的阳性率分别为62.96%(68/108)、57.41%(62/108)和58.33%(63/108),骨软骨瘤中分别为0%(0/28)、32.14%(9/28)和28.57%(8/28)(P<0.05);VM、HIF-1α过表达及MVD与骨肉瘤分级、远处转移及软组织浸润和Enneking分期有关(P<0.05),与患者年龄、性别、部位、肿瘤大体、组织学类型和直径无关(P>0.05);骨肉瘤中VM、HIF-1α过表达与MVD之间呈正相关(P<0.05);VM阳性、HIF-1α过表达及MVD≥22组患者5年存活率分别为8.82%(6/68)、8.06%(5/62)和3.17%(2/63);VM阴性、HIF-1α低表达及MVD<22组分别为87.5%(35/40)、78.26%(36/46)和86.67%(39/45)(P<0.05);Cox多因素分析提示VM、HIF-1α、MVD、远处转移、软组织浸润和Enneking分期是影响骨肉瘤患者预后的独立危险因素(P<0.05)。结论 VM可能是判断骨肉瘤预后的新指标,联合检测VM、HIF-1α及MVD对骨肉瘤的侵袭、转移及预后判断有重要意义。     

超声造影联合微血管成像技术与钆塞酸二钠增强MRI评价原发性肝癌TACE术后复发的诊断效能对照分析

摘要 目的：探讨超声造影（CEUS）联合微血管成像（SMI）技术与钆塞酸二钠磁共振增强（Gd-EOB-DTPA MR增强）扫描对于原发性肝癌（HCC）经导管肝动脉化疗栓塞（TACE）术后复发的诊断效能。方法：收集2014年1月-2019年6月间我院HCC-TACE术后定期随访期间复发且存在完整CEUS、SMI、Gd-EOB-DTPA MR增强、DSA检查影像资料的患者74例,以最终DSA检查为金标准,分别比较CEUS联合SMI、Gd-EOB-DTPA MR增强及CEUS联合SMI+Gd-EOB-DTPA MR增强对于术后复发诊断的准确度、特异度、敏感度、阳性预测值、阴性预测值、约登指数,应用Kappa检验几种检查方式与DSA检查结果的一致性,并对不同诊断方式的诊断效力行组间两两比较。结果：74例HCC-TACE术后DSA证实复发者病灶共99个,CEUS+SMI+Gd-EOB-DTPG MR增强联合检查方法具有最高的诊断价值,其准确度、敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、约登指数及Kappa值分别为94.66%,95.96%,90.63%,96.94%,87.88%,0.87,0.90。组间比较CEUS联合SMI与Gd-EOB-DTPA MR增强诊断HCC-TACE术后复发具有统计学差异（P＜0.05）,但Gd-EOB-DTPA MR增强对于≤2 cm的病灶诊断率明显高于CEUS联合SMI（P＜0.05）,CEUS联合SMI+Gd-EOB-DTPA MR增强较CEUS联合SMI或Gd-EOB-DTPA MR增强诊断率比较均具有统计学差异（P＜0.05）。结论：CEUS联合SMI、Gd-EOB-DTPA MR增强检查均能发现HCC-TACE术后复发病灶,其中Gd-EOB-DTPA MR增强对于≤2 cm病灶诊断效果佳,但CEUS联合SMI+Gd-EOB-DTPA MR增强更有助于HCC-TACE术后复发的早期诊断,可进一步指导临床治疗。