蛙病毒同源蛋白RGV-27R和ADRV-85L的表达及其免疫原性分析

沼泽绿牛蛙病毒(Rana grylio virus,RGV)和大鲵蛙病毒(Andrias davidianus ranavirus,ADRV)同属虹彩病毒科(Iridoviridae)蛙病毒属(Ranavirus)成员,是引起水产动物高死亡率的病原。其同源早期蛋白RGV-27R和ADRV-85L与蛙病毒代表株蛙病毒3型(Frog virus 3,FV3)25R基因所编码的大小为31kD的早期蛋白P31K(FV3-P31K)同一性超过99%。我们在观察和比较RGV与ADRV感染大鲵胸腺细胞(Giant salamander thymus cell,GSTC)显微病变的基础上,将ADRV-85L和RGV-27R基因分别克隆到原核表达载体pET-32a与pMAL-p5X中,转化宿主菌E·coli BL21(DE3)并诱导表达,经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)检测,对这两种蛋白的原核表达及其产物免疫原性进行分析。结果显示这两种基因在载体pET-32a中的表达效率要显著高于pMAL-p5X。随后,取高效诱导表达的pET-32a-RGV-27R产物,经Ni-NTA His-Bind亲和层析分离提纯,获得浓度为1.2 mg/mL的融合蛋白His-RGV-27R,用其免疫动物,制备了抗体27R-Ab,酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测抗体的效价为1∶6.25×10~6。用经正常大肠杆菌菌液和正常GSTC细胞悬液吸附处理后的抗体作为一抗,对被RGV或ADRV感染的GSTC细胞悬液进行Western Blot检测,并以重组原核质粒表达的融合蛋白His-RGV-27R和HisADRV-85L作为阳性对照,以正常GSTC细胞悬液为阴性对照,分别从RGV或ADRV感染的GSTC细胞悬液中,检出大小同为31kD的特异性蛋白条带。本研究证实两种蛙病毒同源早期蛋白RGV-27R和ADRV-85L不仅都能在两栖动物细胞中表达,且具有相同的抗原特性,这为深入研究这类病毒蛋白对蛙病毒复制的影响及其与宿主相互作用的分子机制提供了实验材料。     

土曲霉致双外耳道曲霉病

目的报道1例发生在双外耳道的曲霉病。方法取双耳耵聍行真菌直接镜检,将耵聍接种到沙堡培养基培养,并对培养出的病原菌进行形态学鉴定和rDNA序列分析。结果耵聍真菌直接镜检阳性,耵聍在沙堡培养基25℃培养长出沙褐色菌落,28℃小培养后光镜及扫描电镜下见分生孢子头呈柱状,顶囊半球形,直径约10μm,小梗双层,两层小梗的长度无明显差别,平行紧密生长在顶囊的上2/3处。分生孢子呈球形,小而光滑。分生孢子梗壁光滑、透明。提取真菌总DNA用PCR方法扩增rDNA序列,测序后登录Gene Bank进行比对,该菌与土曲霉菌株ATCC1012 rDNA序列一致性达100%,鉴定为土曲霉。患者外用4%氟康唑注射液直接滴耳,2次/d,治疗1个月后痊愈。结论确诊1例双外耳道土曲霉病,局部应用氟康唑注射液治疗外耳道曲霉病有效。     

槐耳清膏抑制非小细胞肺癌细胞增殖和血管新生的作用机制研究

目的:探讨槐耳清膏抑制非小细胞肺癌(NSCLC)细胞增殖和血管新生的作用机制。方法:选择对数生长期的NSCLC细胞,经过传代培养成细胞株后采用随机法分成低剂量组、高剂量组以及空白对照组。其中低剂量组和高剂量组分别加入5μmol/L、10μmol/L的槐耳清膏进行处理,而空白对照组未加入槐耳清膏处理。利用细胞增殖毒性试验法(MTT)检测NSCLC细胞的存活率,并采用蛋白免疫印迹实验(WB)法检测表皮生长因子受体(EGFR)和血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、磷酸化EGFR(pEGFR)、磷酸化VEGFR2(pVEGFR2)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、磷酸化丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶(pAKT)(pAKT)、磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(pERK1/2)、磷酸化应激活化蛋白激酶1/2(pJNK1/2)、磷酸化-p38(pp38)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)及增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白表达水平。结果:低剂量组、高剂量组NSCLC细胞的存活率均显著低于空白对照组(P<0.05)。与空白对照组相比,槐耳清膏处理NSCLC细胞后,低剂量组、高剂量组中pEGFR、pVEGFR2蛋白的相对表达水平均显著降低(P<0.05)。与空白对照组比较,槐耳清膏处理NSCLC细胞后,低剂量组、高剂量组中PI3K蛋白、pAKT、pERK1/2、pJNK1/2、pp38、Cyclin D1及PCNA的相对表达水平均显著降低(P<0.05)。结论:基于EGFR/VEGFR2信号通路,槐耳清膏对NSCLC细胞增殖和血管新生有一定的抑制作用,可能成为一种针对NSCLC的有用靶向药物。     

黑斑蛙重盘吸虫的线粒体基因组特征及其系统发育研究

重盘科Diplodiscidae Cohn, 1904复殖吸虫是两栖动物最为常见的寄生虫,形态多样,目前未见基于线粒体基因组的遗传多样性研究。本研究记述并分析了寄生于滇蛙Dianrana pleuraden肠道的重盘科重盘属Diplodiscus Diesing, 1836黑斑蛙重盘吸虫D.nigromaculati的线粒体全基因组序列,为后续开展此类吸虫的遗传结构及遗传多样性研究提供了新的数据。黑斑蛙重盘吸虫线粒体基因组全长14 697 bp(GenBank登录号：MW698822),由22个tRNA基因、12个蛋白编码基因、2个rRNA基因和1个非编码区组成;AT含量(60%)高于GC含量(40%),但AT含量为目前已报道同盘总科Paramphistomoidea Fischoeder, 1901中最低;trnG基因和trnE基因的互换成为同盘总科吸虫线粒体基因组遗传结构的重要特征。基于12个蛋白编码基因的系统发育树支持重盘属隶属于重盘科。本研究中,滇蛙为黑斑蛙重盘吸虫的宿主新记录。     

滇蛙两性年龄和异形的研究

本研究测量了2012年7月采自云南省剑川县的125只成体滇蛙Nidirana pleuraden(♀64只,♂61只)的11项形态指标,并使用骨龄学方法测定年龄。结果显示：滇蛙两性的体长与其余形态指标呈正相关,雌性头长、头宽、吻长、前臂及手长、前臂宽、前肢全长、后肢全长、胫长和足长的均值都大于雄性,属于偏雌性的两性异形模式。两性异形指数分别为：1龄组0.05、2龄组0.06、3龄组0.07、4龄组0.08,即两性异形指数随年龄增大而增加。这反映出随年龄增长,雌性的繁殖投入增加,而雄性的繁殖机会受体型的影响较小,符合生育力选择假说。     

十字花科植物PEBP基因家族的分子进化

近年来植物基因组测序物种数量的指数增长, 为我们对植物环境适应性状的遗传和变异的全面理解提供了保障。磷脂酰乙醇胺结合蛋白(phosphatidylethanolamine-binding protein, PEBP)在植物的开花转变和株型建立中起着重要作用, 一直是植物生物学研究关注的热点领域之一。然而对该家族并没有利用新近测序的基因组数据进行比较基因组分析, 制约了对其在分子水平上的进化研究。为了确定PEBP基因家族的分子进化机制, 本研究利用生物信息学方法开展了7种十字花科植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)、琴叶拟南芥(A. lyrata)、小鼠耳芥(A. pumila)、亚麻荠(Camelina sativa)、甘蓝(Brassica oleracea)、白菜(B. rapa)和油菜(B. napus)的PEBP基因家族成员的全基因组鉴定、结构特征和比较进化分析。从7个物种中共鉴定出91个PEBP基因, 系统进化分析表明它们分属5个亚家族: MFT、FT/TSF、TFL1、CEN和BFT。基因结构分析发现甘蓝、白菜和油菜的CEN基因内含子明显比其余4个物种的内含子长。蛋白结构域分析表明MFT比其他4个亚家族成员少了一个motif 2, TFL1比其他亚家族多了motif 8。选择压力分析发现7个物种PEBP同源基因均受到较强的纯化选择, 其中TFL1亚家族受到的纯化选择最弱。共线性分析表明十字花科植物PEBP基因家族随古代多倍体事件发生不同程度的扩张, TSF在甘蓝、白菜和油菜中丢失。非生物胁迫下, 在拟南芥中过量表达小鼠耳芥的一个MFT基因, 转基因拟南芥种子的萌发率明显低于野生型, 暗示MFT基因在调控种子萌发上的功能保守。本研究为深入研究十字花科植物PEBP基因的进化特征和生物学功能奠定了基础。     

云南景东地区四川湍蛙的核型,C—带和Ag—NORs的研究

本文报道了云南景东四川湍蛙的核型：２ｎ＝２６（２０Ｍ＋６ｓＭ），ＮＦ＝５２，５＋８模式，次缢痕以及Ａｇ－ＮＯＲｓ均位于６ｐｉｎｔｅｒ，Ｃ－带阳性分布于全部染色体的着丝点区域和８ｑｉｎｔｅｒ，但６ｐｉｎｔｅｒ１２ｐｔｅｒ和１３ｑｔｅｒ等处间或也显示Ｃ－带正染。没有发现与性别相关的异形染色体。与采自四川宝兴地区的居群作了比较，并讨论了细胞地理学问题。     

福建九龙棘蛙和小棘蛙的核型和Ag—NORs研究

福建两种棘蛙的核型和Ａｇ－ＮＯＲｓ观察结果如下：九龙棘蛙，２ｎ＝２６（２２Ｍ＋４ＳＭ），ＮＦ＝５２，５＋８模式，Ａｇ－ＮＯＲｓ位于６ｐｉｎｔｅｒ，小棘蛙，２ｎ＝２６（２０Ｍ＋６ＳＭ），ＮＦ＝５２，５＋８模式，次缢痕和Ａｇ－ＮＯＲｓ在６ｐｉｎｔｅｒ。二者均未发现与性别分化相关的异形染色体。根据已知棘蛙属内的核型资料，对该属种间和居群间的核型演化机制进行了讨论。     

几种制剂对棘胸蛙排精作用的观察

本试验按活蛙取精进行人工授精的要求，利用蛙脑垂体液，绒毛膜促进腺激素，肾上腺素分别注射雄棘胸蛙，对促使其排精的作用了对比观察。结果说明，蛙脑垂体液有明显地促使雄排出优质精液的作用，奏效快，持续时间长，实用价值很高；绒毛膜促性腺激素和肾上腺素的作用均不理想，不宜用于棘胸蛙的人工排精。     

中国耳头甲螨科三新种(蜱螨亚纲:甲螨亚目:耳头甲螨科)

记述采自我国云南勐仑的耳头甲螨科３新种,即滇双瘤甲螨,拱大头甲螨和多纹大头甲螨。