起始密码子下游区域AT含量优化工具BestAT的开发与应用

基因的表达水平受到起始密码子下游区域AT含量的影响,从巨大的序列集中筛选出具有特定AT含量和密码子用法特征的同义序列是一个繁琐的工作。本文研发AT含量优化工具"BestAT",初步解决了自动获取海量同义序列和充分展示同义序列的密码子用法特性两个关键问题,并且实现了与密码子用法数据库(CUD)的无缝结合,采用了密码子参数的原位标示和AT含量曲线等直观方式展示序列特性,为这类实验设计提供有力的支持。     

硬脂酰-辅酶A脱氢酶基因在食品级乳酸菌中的表达

为了实现硬脂酰-辅酶A脱氢酶1编码基因在乳酸乳球菌中的表达,采用PCR技术扩增获得人类scd1的编码序列。Nco I和Xba I双酶切后定向插入到食品级表达载体pNZ8149中,构建表达载体pNZ8149-scd1。电转化乳酸乳球菌NZ3900,经菌落PCR和测序鉴定scd1基因成功插入到乳酸乳球菌中。在乳链菌肽诱导下进行scd1的表达,转化株提取脂肪酸,进行脂肪酸含量的气相色谱分析。结果显示,SCD1转化菌株中的C16∶1n-7和C18∶1n-7脂肪酸组分比转化pNZ8149的对照组乳酸菌分别提高了92%~169%和53%~127%。文中以scd1基因为例,尝试并证明了脂肪酸脱氢酶类基因能够在食品级乳酸菌中有效表达,为后续研究奠定了基础。     

大肠杆菌共表达LeGGPS2、LePSY1和crtI基因合成番茄红素

利用大肠杆菌研究番茄红素的合成,不仅可以获得副产物少的高产菌株,而且可以探讨基因或基因簇的功能。文中将番茄LeGGPS2和LePSY1的cDNA序列,及欧文氏菌crtI的编码序列分别添加上核糖体结合位点后,以单独或组合的方式受控于T7启动子和终止子,在大肠杆菌菌株BL21(DE3)中进行表达和诱导番茄红素合成。结果显示,仅T7::crtI-LeGGPS2-LePSY1三价基因共表达时才能合成番茄红素,且将种子液以1∶50接种于含3%蔗糖的LB培养基(pH 6.8)中,于37℃摇8 h左右的对数生长后期加IPTG至80μmol/L,30℃诱导表达5 h的发酵条件下,获得2.124 mg/g DCW的番茄红素。该结果既验证了原核化的番茄LeGGPS2和LePSY1基因及与crtI基因协同作用的功能,又为在番茄质体中建立独立的番茄红素合成途径奠定了基础。     

生物制氢及其与以海水为介质的高盐有机废水处理的耦合研究

当前,全球能源系统的主体是＂碳基能源＂——石油和煤等。这些不可再生的资源已日渐枯竭,而且大量使用会破坏地球生态系统。因此,用＂氢基能源＂逐步取代＂碳基能源＂已成为发达国家能源战略的首选目标,有的国家甚至将这一目标定在本世纪中叶。对于中国等发展中国家,大力开发生物质能等新的可再生＂碳基能源＂,同时加速发展＂氢基能源＂,争取提前进入氢能时代,才能实现可持续发展,甚至跨越式发展。制氢技术包括非生物制氢和生物制氢。非生物制氢目前已小量生产和应用,生物制氢的研究也有相当长的时间,其中影响生物制氢进入实用的主要因素是能耗和生产成本过高。因此,如果作为一个孤立的技术系统,生物制氢只能作为战略性项目。首先介绍了生物制氢的主要原理、目前限制生物制氢产业化的关键限制因子;提出了从系统论的原理出发,通过技术集成,突破生物制氢成本的＂瓶颈＂,达到环保和资源利用的双重目的,使其提前实用化;最后,重点阐述了以海水为介质的高盐有机废水的生物制氢技术的研究进展,尤其介绍我国在相关方面的研究进展。     

琥珀酸脱氢酶实验的优化设计

琥珀酸脱氢酶作用的实验是《生物化学》课程的重要实验之一。由于材料来源、成本、操作、结果等在实验教学中存在的问题,影响了该实验的效果和开出率。采用普通鸽子胸脯处肌肉作为实验材料,并对实验条件和程序进行优化,从而使教学取得了较好的效果,实验开出率也得以提高。     

牦牛乳酸脱氢酶B基因突变体的克隆鉴定研究

通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析证实牦牛（Bos grunniens）乳酸脱氢酶存在两种类型,根据LDH同工酶谱的特点推测牦牛LDH多态是由B基因变异所致,并由此将凝胶电泳中迁移率快的LDH同工酶谱带称为LDH－Bf类型,迁移率慢的称为LDH－Bs类型．为阐明牦牛LDH变异体的分子机制,实验从牦牛心脏组织中提取总RNA,采用RT-PCR方法分别克隆了LDH－Bf和LDH-Bs两种类型的B基因cDNA全长序列;序列比对分析发现LDH-Bf和LDH-Bs基因存在4个碱基差异;依据cDNA序列推导的氨基酸序列的比对分析,发现两者之间存在两个氨基酸差异;利用Deepview分子建模软件进行的牦牛H亚基及LDH1突变体的高级结构预测,发现突变的两个氨基酸都能产生新的H键,影响整个蛋白分子的H键网络,并进一步导致蛋白分子空间结构的变化．     

克雷伯氏菌甘油脱氢酶dhaD的克隆表达、纯化及酶学性质研究

以克雷伯氏菌基因组DNA为模板,扩增得到编码甘油脱氢酶（GDH）的基因dhaD,将其克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a(+)上,在E.coliBL21（DE3）中诱导表达,利用表达载体pET-28a(+)上的6·His-Tag标记选用Ni柱亲和层析法纯化表达具有活性的甘油脱氢酶(GDH),纯化后比酶活达到156U/mg,纯化倍数达4.6倍,回收率为67.4%。并初步研究了该酶的酶学性质,酶反应的最适pH为11.0,在pH7.0～12.0范围内稳定;酶反应的最适温度为30℃,稳定范围为25～45℃; 酶动力学参数以甘油为底物的Km为0.54 mmol/L, Vmax为0.49 μmol/(mL·min)。     

高效产氢菌株Enterococcus sp. LG1的分离及产氢特性

采用Hungate厌氧培养技术分别从厌氧污泥、好氧污泥及河底泥中分离出12株厌氧产氢细菌,并对其中的Enterococcus sp.LG1(注册号:EU258743)进行了研究.结果表明,该株细菌为专性厌氧菌,经革兰氏染色结果为阴性.通过16S rDNA碱基测序和比对证实,该菌株是目前尚未报道过的1个新菌种,初步确定其细菌学上的分类地位.同时,以灭菌预处理的污泥为底物培养基,对该菌的产氢能力及污泥发酵过程中底物性质变化(SCOD、可溶性蛋白质、总糖和pH值等)进行了探讨.实验结果显示,产氢茵Enterococcus sp.LG1的发酵过程中只有H2和CO2产生,无CH4产生.产气量最高为36.48 mL/g TCOD,氢气含量高达73.5%,为已报道文献中以污泥为底物发酵制氢中之最高.根据污泥发酵产物分析得知,该菌的发酵类行为典型的丁酸型发酵.     

利用甲硝唑及外加氧方法筛选耐氧产氢Klebsiella oxytoca HP1突变菌株

摘氢酶是生物制氢的关键酶,大多数氢酶因对氧极敏感而易失活,因此提高氢酶的氧耐受性对生物制氢有重要意义。本研究利用1％甲基磺酸乙酯对Klebsiella oxytoca HPl进行了两轮诱变,经40mmol／L甲硝唑和21％氧联合处理1h（第一轮诱变）或2h（第二轮诱变）进行筛选。所得突变菌株经产氢测试,结果在15％氧浓度条件下,第一代突变菌株HPl-A15产氢活性为出发菌株Klebsiella oxytoca HPl的3.70倍,在21％氧浓度条件下第二代突变菌株HPAl5-37产氢活性为HPl-A15菌株的2.75倍,是出发菌株的11倍。突变菌株HPl-A15和HPAl5-37具有较好的遗传稳定性。本试验结果说明利用MNZ和外加氧的方法适用于兼性厌氧菌耐氧产氢突变菌株的筛选。