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351.
目的:制备链亲合素标记的鼠白细胞介素21融合蛋白(mIL21-SA),治疗小鼠表浅膀胱癌。方法:构建mIL21-SA-pET21质粒,BL21表达,Ni-NTA纯化,透析复性,Western blot鉴定,MTT法检测其对小鼠胸腺细胞的增殖作用,流式检测其对生物素化的MB49锚定修饰率。建立小鼠MB49表浅膀胱癌模型,将mIL21-SA锚定在小鼠膀胱表面进行治疗并观察小鼠存活时间。60d后对mIL21-SA治疗后存活小鼠进行二次攻击。结果:mIL21-SA可以促进T细胞增殖,且具有SA介导的高效结合已生物素化的MB49表面的功能(修饰率98.74%)。膀胱灌注60d后,mIL21-SA组有10只(10/25)存活,二次攻击后,仍有6只(6/10)存活。与对照组比较均有统计学意义(P<0.05)。结论:该实验研制了具有双重活性的mIL21-SA,mIL21-SA锚定修饰治疗表浅膀胱癌是一种有效的免疫治疗方法。  相似文献   
352.
目的:融合表达表皮生长因子受体(EGFR)胞外功能区,为制备针对该分子的特异性抗体提供可用的靶标抗原。方法:通过PCR扩增EGFR胞外区基因,将其克隆入真核表达载体pABhFc中,重组质粒瞬时转染HEK293T细胞,进行EGFR的瞬时分泌表达,纯化获得电泳纯级的分泌蛋白,并通过ELISA、Western印迹、Biacore3000系统对融合蛋白进行鉴定。结果:经测序证实扩增得到了正确的EGFR胞外区基因序列,SDS-PAGE初步确认获得了单、双体的EGFR胞外区,ELISA检测证实双体融合蛋白hFc-EGFR可与商业化的EGF特异性结合,Western印迹检测证实单体融合蛋白His-EGFR可与商业化抗体特异性结合;经Biacore3000蛋白分子相互作用系统测定,双体融合蛋白hFc-EGFR与商业化抗体爱必妥的亲和力达0.5 nmol/L。结论:利用哺乳动物细胞HEK293T分泌表达系统获得了结构正确的单、双体2种类型的EGFR胞外区融合蛋白纯品,将用于抗EGFR特异性抗体的筛选。  相似文献   
353.
酿酒酵母表面展示表达系统及应用   总被引:3,自引:0,他引:3  
酵母细胞表面展示表达系统是一种固定化表达异源蛋白质的真核展示系统,即把异源靶蛋白基因序列与特定的载体基因序列融合后导入酵母细胞,利用酿酒酵母细胞内蛋白转运到膜表面的机制(GPI锚定)使靶蛋白定位于酵母细胞表面并进行表达。它利用细胞表面展示技术使外源蛋白固定化于细胞表面,从而生产微生物细胞表面蛋白,可应用于生物催化剂、细胞吸附剂、活疫苗、环境治理、蛋白质文库筛选、高亲和抗体、生物传感器、抗原/抗体库构建、免疫检测及亲和纯化、癌症诊断等领域。国内对这一方面研究较少,本文主要介绍了该技术的基本原理、研究现状、应用及其发展前景。  相似文献   
354.
229例慢性胃炎患者幽门螺杆菌培养及耐药情况   总被引:2,自引:0,他引:2  
目的了解慢性胃炎患者H.pylori感染及其耐药情况,为临床治疗提供参考。方法慢性胃炎患者胃镜活检标本培养分离H.pylori,对分离的H.pylori采用纸片扩散法进行耐药性检测。结果229例患者分离出97株H.pylori;H.pylori分离阳性率为42.36%(97/229),其中男性分离率为43.79%(67/153),女性分离率为39.47(30/76);92株H.pylori对抗生素的耐药性分别为:甲硝唑8.7%,克拉霉素7.6%,阿莫西林1.1%、呋喃唑酮1.1%,阿奇霉素4.4%,左氧氟沙星0%。结论慢性胃炎患者H.pylori感染率较高,但与性别、年龄无关;慢性胃炎H.pylori对常用抗生素敏感,建议采用左氧氟沙星、阿莫西林、呋喃唑酮进行治疗。  相似文献   
355.
目的:构建表达anti-CD20 scFv/CD80/CD28/ζ重组非复制型逆转录病毒,转染Jurkat细胞株使其表达目的蛋白.方法:采用DNA重组技术把pBULLET上的CD28-ζcDNA插入到已含anti-CD20 scFv/CD80的真核逆转录病毒载体pLNCX质粒上,转染PA 317细胞株,收获上清液获非复制型逆转录病毒,感染NIH 3T3细胞株,用PCR、流式细胞术检测目的基因在NIH 3T3细胞的表达情况,确定病毒滴度.挑取高滴度的包装细胞株收获病毒,感染Jurkat细胞,经G418筛选细胞,用RT-PCR检测目的基因表达情况.结果:经酶切及测序鉴定均证实pLNCX/anti-CD20 scFv/CD80/CD28/ζ的成功构建; 用PCR能够从逆转录病毒感染的NIH 3T3细胞中扩增出一条与目的基因大小一致的DNA片段; 流式细胞术检测显示该目的基因能够在NIH 3T3细胞中表达目的蛋白; 经RT-PCR,能够从转染的Jurkat细胞株中扩增出1条与目的基因大小一致的DNA片段.结论:成功构建高滴度表达anti-CD20 scFv/CD80/CD28/ζ非复制型逆转录病毒,并能在Jurkat细胞中表达目的蛋白.  相似文献   
356.
包玎  李伟  石乐明  李全贞 《生物工程学报》2017,33(12):1979-1988
构建编码NMDAR1蛋白膜外片段的原核表达重组质粒,在大肠杆菌中诱导表达、纯化并鉴定其免疫反应原性。根据人NMDAR1基因序列,利用Phyre 2软件预测蛋白的三级结构并分析其结构域。设计引物用RT-PCR方法扩增编码NMDAR1膜外蛋白不同结构域的核酸片段,并插入原核表达载体pCold-SUMO构建重组质粒。转化DH5α感受态细胞,菌落PCR鉴定,阳性单克隆进行测序验证。鉴定正确的重组体转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白的表达和纯化,Ni-NTA柱亲和层析和凝胶过滤层析纯化蛋白,酶切切除融合蛋白6His-SUMO标签,用AKTA Purifier进行凝胶过滤层析,收集纯化蛋白。利用SDS-PAGE鉴定蛋白纯度,并用Western blotting进行免疫反应性鉴定。克隆获得NMDAR1膜外部分的三段DNA序列,分别是NR1-M1(编码19–393 aa)、NR1-S1(编码394–544 aa)和NR1-S2(编码663–800 aa)。其中NR1-S1和NR1-S2片段之间以G(甘氨酸)和T(苏氨酸)作为接头连接成为复合片段。经菌落PCR筛选和测序鉴定,成功构建了重组质粒p Cold-SUMO-M1和p Cold-SUMO-S1-GT-S2。SDS-PAGE鉴定结果表明重组质粒在大肠杆菌中经诱导可表达可溶性NR1-M1及NR1-S1-GT-S2蛋白。对表达产物进行亲和层析和凝胶过滤层析获得了高纯度的目标蛋白。Western blotting证实纯化的目的蛋白能与相应抗体发生特异性结合反应。本研究成功构建了NMDAR1蛋白膜外抗原结构域的原核表达系统,并获得了具有免疫反应性的NR1-M1及NR1-S1-GT-S2纯化蛋白。该蛋白有望用于NMDAR1蛋白的功能研究及自身抗体的检测。  相似文献   
357.
Apelin对大鼠离体肺动脉环的舒张作用及与一氧化氮的关系   总被引:1,自引:0,他引:1  
目的:探讨新的小分子活性肽Apelin对大鼠离体肺动脉环的舒张作用及与一氧化氮(NO)途径的关系,并比较低氧大鼠的肺动脉环对Apelin的舒张反应与正常大鼠的差异。方法:36只大鼠随机分为正常组与低氧组;采用离体血管环灌流法,检测Apelin对去甲肾上腺素(NE)预收缩的大鼠离体肺主动脉环的舒张效应,观察去内皮或用一氧化氮合酶抑制剂(L-NAME)、可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)抑制剂(ODQ)孵育后该舒张率的变化。结果:①在正常组大鼠肺动脉环,Apelin(0.01~100 nmol/L)具有浓度依赖性的舒张效应。去除内皮后,Apelin对NE预先收缩的肺血管舒张效应明显减弱(P〈0.01)。L-NAME或ODQ预孵育后,Apelin的舒张效应均明显减弱(P均〈0.01)。②低氧组大鼠的肺动脉环对Apelin的舒张反应明显低于正常组大鼠,在最大浓度100 nmol/L时,Apelin的效应低60.45%(P〈0.01),而两组EC50相比差异无显著性(P〉0.05)。结论:Apelin具有内皮依赖性的舒张肺动脉环的作用,该效应与NO-sGC-cGMP信号途径有关;低氧大鼠的离体肺动脉环对Apelin的舒张反应减弱。  相似文献   
358.
目的:观察口服AdipoRon对2型糖尿病小鼠脾脏和胰腺功能的影响,为AdipoRon的临床应用提供基础资料。方法:将40只C57/BL6雄性小鼠随机分为正常对照组(NC,n=10)和造模组(n=30),并分别给予普通饲料和高脂高糖饲料喂养。4周后,造模组小鼠腹腔注射链脲佐菌素(STZ,40 mg/kg)以诱导建立2型糖尿病模型。造模成功后将糖尿病模型小鼠随机分为糖尿病模型组(DM)、高剂量AdipoRon(50 mg/kg)(DM+H)组、低剂量AdipoRon(20 mg/kg)(DM+L)组,每组10只。DM+L组和DM+H组灌胃相应浓度的AdipoRon(使用去离子水溶解AdipoRon),NC组和DM组灌胃等体积去离子水,每日灌胃1次,灌胃10 d。末次干预后禁食12 h,处死小鼠取血液、胰腺和脾脏。HE染色光镜下观察胰腺的病理改变; ELISA法检测小鼠胰腺和脾脏组织中胰岛素受体(INSR)、胰岛素受体底物1(IRS-1)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)蛋白质含量;小鼠脾脏系数; Western blot法检测胰腺组织中pIRS-1蛋白质水平;实时荧光定量PCR检测胰腺组织中insulin mRNA表达。结果:光镜下可见正常组小鼠胰腺组织排列紧密、饱满、胰岛体积大,DM组小鼠胰腺组织排列较为疏散、胰岛体积较小,口服AdipoRon组小鼠胰腺组织基本紧密、饱满、胰岛体积略小。与NC比较,DM组小鼠胰腺和脾脏TNF-α水平明显升高,INSR、IRS-1水平均降低,脾脏系数、胰腺p-IRS-1蛋白质水平和insulin mRNA表达均降低,均具有统计学意义(P<0.05);与DM组比较,口服AdipoRon组小鼠胰腺和脾脏TNF-α水平明显下降,INSR和IRS-1水平均升高,脾脏系数升高,DM+H组胰腺p-IRS-1蛋白质水平和insulin mRNA表达均升高(P<0.05);与DM+L组比较,DM+H组小鼠TNF-α水平明显下降,INSR和IRS-1水平均升高(P<0.05)。结论:口服AdipoRon可通过减弱糖尿病小鼠炎症反应,上调INSR表达、提高p-IRS-1水平,从而对糖尿病小鼠脾脏和胰腺组织有一定的保护作用。  相似文献   
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