枯草芽孢杆菌ZC-7中性蛋白酶的分离纯化及酶学性质研究

枯草芽孢杆菌ZC-7的发酵液,经离心分离得到粗酶液,再经硫酸铵盐析、中空纤维膜除盐浓缩、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephadex G-75柱层析等步骤获得电泳纯的中性蛋白酶。SDS-PAGE测得其分子量大约为42KDa。以酪蛋白为底物时,该酶的Km为5×10-3,Vmax为2.5×104ug/min,酶的最适作用pH为7.0,最适反应温度为55℃,在pH6.5～8.0, 40℃以下较稳定,对1mol/L H2O2具有一定的耐受性。EDTA、异丙醇和乙醇对该酶有抑制作用,Ca2+、Mg2+和Li+离子对其具有保护作用。     

嗜碱性芽孢杆菌PB92碱性蛋白酶分别在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中表达

从Bacillus alcalophillus PB92中扩增出碱性蛋白酶基因Mapr,Mapr分别插入到大肠杆菌载体pET-22b( )和枯草芽孢杆菌载体pWB980中构建成重组分泌型表达载体pET22b( )-Mapr、pWB980-Mapr。碱性蛋白酶基因分别在大肠杆菌宿主BL21和枯草芽孢杆菌DB104中得到表达。SDS-PAGE分析,重组蛋白酶的分子量为28kD。在大肠杆菌,所得酶活为231U/ml,而在枯草芽孢杆菌,其酶活为1563U/ml。大概是由于碱性蛋白酶在枯草芽孢杆菌折叠成熟机制与大肠杆菌的不同造成的。     

高产碱性蛋白酶菌株HAP26选育

通过对HAP26复合诱变(NTG+N+离子注入),选育出一株碱性蛋白酶活力达3.5×107U.L-1的菌株HAP3-26-2。该酶生物合成类型属于半藕联合成型。碱性蛋白酶最适温度为40℃,在pH 7~11的范围内,酶活力比较稳定。     

甲醇毕赤酵母表达木质素过氧化物酶的研究

将含有黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosprium)木质素过氧化物酶基因的甲醇毕赤酵母工程菌进行了鉴定和筛选,筛选得到木质素过氧化物酶活力高的菌株PMLIP08。确定了一步法发酵的最优葡萄糖浓度,优化其发酵培养条件,结果表明葡萄糖的添加量为10g/L时,发酵条件为pH3.0,诱导温度24℃,培养时间12h,甲醇添加量1.1%,诱导时间72h后发酵液中酶活可达4888U/L。     

根霉12#发酵产生纤溶酶的酶学性质

溶栓疗法是血栓性疾病安全有效的治疗手段 ,开发新型纤溶酶具有实际应用意义。分离自南方小酒药的根霉 12^#以豆粕和麸皮为原料可产生纤溶酶。已采用盐析 ,疏水层析、离子交换层析和凝胶层析方法对纤溶酶分离提纯。提纯的纤溶酶比活力 2143u/mg(尿激酶单位 ) ,有直接溶解血栓和激活纤溶酶原的双重溶栓作用 ,降解纤维蛋白α、β和γ肽链速度快 ;最适作用温度 4 5℃ ,适宜作用pH范围 6.8～8.8;等电聚焦方法测定该酶等电点 8.5± 0.1;只分解生色底物N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA ,其米氏常数K_m 为 0.23mmol/L ,酶转换数K_cat为 16.36s^-1;Molish实验和甲苯胺蓝实验均证明该酶为糖蛋白 ,地衣酚_硫酸法测得该酶含糖量 470% ;EDTA、PMSF、PCMB对该纤溶酶有抑制作用 ,说明活性中心含有巯基、金属和丝氨酸 ;N端12个氨基酸序列为NH2-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly,与其它生物来源的纤溶酶相比较没有同源性。根霉 12^#产生的纤溶酶为新型纤溶酶,有希望开发成溶栓药物。     

基因工程菌里氏木霉染色体DNA的提取方法

研究基因工程菌株里氏木霉(Trichoderma Teesei)染包体DNA的提取方法。采用冷冻研磨CTAB法、氯化苄SDS法和冷冻研磨SDS法三种提取DNA的力法。通过琼脂糖凝胶电泳埘提取的DNA进行检测。结果表明：冷冻研磨CTAB法更适合此类DNA的提取。对冷冻研磨CTAB法提取条件进行了优化。用该法提取的DNA上的外源基因t—PAcDNA部分片段进行PCR扩增,获得良好结果。用本实验冷冻研磨CTAB法提取的DNA完全适用于PCR和其它的分子生物学操作的要求。     

白腐菌产锰过氧化物酶培养基的优化

黄孢原毛平革菌(Phanerochaete Chrysosporium)5．776在初始发酵培养基中产胞外锰过氧化物酶活力极低。为了显著提高锰过氧化物酶活力,对初始发酵培养基进行优化。通过调整培养基中碳源、氮源种类和含量,吐温80添加量,Mn^2 终浓度,静置培养温度、时间,采用分光光度计法测定酶活力,发现黄孢原毛平革菌在限氮高锰培养基中产生较高的锰过氧化物酶。静置液体培养的优化条件是：葡萄糖10g／L;酒石酸铵2mmol／L;吐温80 lg／L;Mn^2 9．9μg／L;于34℃静置培养5d;产MnP活力达1200U／L,比优化前提高了近17倍。     

高温和H2O2诱导酵母细胞产生活性衍生物的研究

对高温和H2O2应激条件下产生活性酵母细胞衍生物(Live Yeast Cell Derivative,简称LYCD)进行了研究。结果表明：低剂量的预处理(37℃和0．2mmol／LH2O2)能够增加细胞内谷胱甘肽(GSH)含量,提高超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性。两种预处理均可以诱导对致死浓度H2O2的抗性。通过37℃和0．2mmol／LH2O2处理酵母细胞后,提取LYCD并添加到酵母细胞培养液中,发现细胞在致死浓度H2O2作用下的存活率明显提高,说明温度和H2O2刺激酵母细胞形成的LYCD对细胞氧化具有抵抗作用。     

枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶基因的克隆及其序列分析

根据Lampel报道的葡萄糖脱氢酶基因序列设计合成两条引物,以野生型枯草芽孢杆菌染色体DNA为模板,PCR扩增得到含有葡萄糖脱氢酶基因的大约780bp的DNA片段,将其克隆到pUC-T载体中。序列分析表明,克隆得到的葡萄糖脱氢酶基因含有783bp,编码261个氨基酸的蛋白质。得到的基因序列与文献报道的进行比较,其核苷酸同源率为75．5％,编码氨基酸序列的同源率为83．9％。     

补料分批法高密度培养凝结芽孢杆菌

研究在摇瓶条件下通过补加含有不同浓度的葡萄糖与酵母膏的料液及不同流加方式对凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)TQ33菌体量和芽孢生成量的影响,确定了补料液中的葡萄糖与酵母膏比例为61(w/w),采用将葡萄糖浓度控制在3.0g/L～6.0g/L的流加方式进行高密度培养凝结芽孢杆菌.在5L自动发酵罐中进行补料分批培养,最终菌体浓度达到4.5×109cfu/mL,芽孢浓度为1.2×109cfu/mL,分别是分批培养的5.9倍和3.8倍.