禽病原性大肠杆菌iro和tsh基因缺失株的构建

通过SSH和SCOTS研究, 铁系统(Iro)和温度敏感性血凝素(Tsh)在禽病原性大肠杆菌(APEC)的感染中可能发挥重要作用。基因检测发现, 在243个禽源大肠杆菌分离株中, 有205株为iro+菌株, 其中高、中度和低致病株分别为89.8%(184/205)、8.8%(18/205)和1.5%(3/205); 有167株为tsh+菌株, 高、中度、低致病株分别为87.4%(146/167)、12.6%(21/167)和0%(0/167), 结果显示iro+或tsh+株大多数为高致病株。为了确定iro和tsh基因在APEC致病力中的作用, 以APEC E037株为基础, 通过自杀性载体分别构建了iro和tsh基因缺失突变株E037(Δiro)、E037(Δtsh)和E037(ΔiroΔtsh)。动物感染性试验表明, 突变株在鸡体内的繁殖能力和致病性均明显下降, 但两个基因的协同致病作用不显著。进一步证实Iro和Tsh为APEC重要的致病因子。     

转座子随机插入鉴定肠炎沙门氏菌生物膜形成相关基因

[目的]生物膜在沙门氏菌的致病性和引起沙门氏菌食物中毒等方面起着重要作用,本研究为了鉴定影响沙门氏菌生物膜形成的基因.[方法]利用结晶紫染色定量法对74株鸡源的肠炎、鸡白痢和鸡伤寒沙门氏菌进行生物膜测定,选择生物膜生长较好的肠炎沙门氏菌C050041,采用转座子随机插入法构建突变株库.[结果]84%的鸡源沙门氏菌菌株可在塑料表面形成生物膜;通过转座子插入获得1924个突变株,筛选的生物膜降低突变株经生长曲线测定、测序和序列比对及Southern blot分析鉴定出15个插入基因,它们分别为metE、ompR、rpoS、,和G、rfaJ、rfaK、rfaP、rfbH、rhlE、spiA、steB、tpx、ybdN和2个未知功能的基因.[结论]我们鉴定出了多个影响生物膜形成的新基因,这些基因的发现为进一步研究沙门氏菌生物膜形成的调控机制,研制减毒沙门氏菌疫苗奠定了基础.     

鸡γ-干扰素在杆状病毒系统中的表达

目的：获得具有生物学活性的重组鸡γ-干扰素（ChIFN-γ）。方法：应用RT-PCR方法扩增ChIFN-γ基因cDNA,将其克隆入杆状病毒表达系统的转移载体pFastBac1,构建重组质粒pFast-ChIFN-γ,通过位点特异性转座,将ChIFN-γ基因整合到Bacmid穿梭载体中,构建重组质粒pBac-ChIFN-γ并转染昆虫细胞Sf9,采用间接免疫荧光试验（IFA）、ELISA试验鉴定重组ChIFN-γ的表达,通过细胞病变抑制法检测重组蛋白的抗病毒活性。结果：IFA、ELISA与细胞病变抑制试验结果显示,重组ChIFN-γ在杆状病毒系统中获得表达,其抗病毒活性达5×103～1×104U/mL。结论：重组ChIFN-γ的获得为其开发应用提供了重要的生物材料。     

新城疫病毒融合蛋白在转基因水稻叶片中的表达及其免疫原性

利用转基因植物作为生物反应器表达抗原蛋白具有广阔的应用前景。以新城疫病毒融合蛋白（NDVF）基因1.7kb全长编码区序列为外源基因与组成型表达的玉米泛素蛋白基因（Ubi）启动子和农杆菌胭脂碱合成酶基因（nos）终止子组成嵌合基因,构建了适宜于农杆菌介导转化水稻的转化载体pUNDV,经根癌农杆菌介导的遗传转化方法将由Ubi动子驱动的NDVF嵌合基因导入水稻细胞中,经潮霉素抗性筛选,共再生获得了6个独立的转基因株系。PCR分析结果表明NDVF基因已整合到水稻基因组中。ELISA和Western blot分析结果证实NDVF蛋白在部分转基因水稻叶片组织中获得表达,其中植株F5叶片组织中具有较高的表达水平。将F5叶片可溶性总蛋白皮下注射免疫BALB／c小鼠,结果表明能够诱导小鼠产生一定水平的NDVF蛋白特异抗体。     

以减毒沙门氏菌运送的H5亚型禽流感病毒DNA疫苗的构建及其对小鼠的免疫原性

根据GenBank中已发表的H5亚型禽流感病毒HA基因序列,设计一对引物,通过RTPCR扩增鹅源H5亚型高致病力禽流感病毒HA基因,测序确认后,将其克隆入真核表达载体pVAX1和asdpVAX1得到重组表达载体pVAX1HA和asdpVAX1HA。将重组质粒转染P815细胞,经间接免疫荧光试验证实,HA基因在细胞内得到了瞬时表达。进一步将重组质粒转化减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550得到两种运送DNA疫苗的重组沙门氏菌X4550（pVAX1HA）和X4550（asdpVAX1HA）,以1×109CFU/只的剂量两次口服免疫BALB/c小鼠,免疫小鼠不仅可以检测到HA特异性的血清抗体应答,而且还能抵抗稳定表达H5亚型禽流感病毒HA基因的P815肥大细胞瘤的攻击,说明该运送DNA疫苗的减毒沙门氏菌系统在体内能够成功释放所携带的质粒,并且能够刺激机体产生保护性免疫应答。     

牛结核γ干扰素ELISPOT检测方法的建立

本研究旨在建立一种牛结核γ干扰素ELISPOT检测方法,并评价该方法用于牛结核病检测的价值。通过筛选与天然牛γ干扰素特异性结合的单克隆抗体分别作为包被抗体和检测抗体,并探索不同的实验条件确定最佳包被抗体浓度、最佳细胞数量和最佳检测抗体浓度等,建立牛γ干扰素ELISPOT检测方法。采集30头奶牛尾静脉血并分离外周血单个核细胞,以结核菌素作为刺激原,使用建立的ELISPOT检测方法进行牛结核病检测,并与BOVIGAMTM ELISA试剂盒检测结果进行比较。筛选到两株与天然牛γ干扰素特异性结合的单抗2G5和5E11,确定ELISPOT检测方法的最佳实验条件为:包被抗体2G5浓度2.5μg/m L,每孔细胞数量2.5×105个,检测抗体Bio-5E11浓度1μg/mL。使用建立的ELISPOT检测方法与BOVIGAMTM ELISA试剂盒对30头奶牛进行同步检测,结果显示,以BOVIGAMTM ELISA试剂盒检测结果作为参考标准,14头BOVIGAMTM ELISA试剂盒检测阳性牛中,ELISPOT方法检出的阳性牛为11头,敏感性为78.6%(11/14);16头BOVIGAMTM ELISA试剂盒检测阴性牛中,ELISPOT方法检出的阴性牛为12头,特异性为75%(12/16)。应用结核菌素作为刺激原的牛结核γ干扰素ELISPOT检测方法可用于牛结核病辅助检测,具有潜在的临床应用价值。     

选择性捕获禽病原性大肠杆菌体内转录序列

采用选择性捕获转录序列(SCOTS)方法鉴定禽病原性大肠杆菌E037株(血清型O78)在感染SPF鸡过程中的转录表达基因。通过总RNA分离、cDNAs合成、PCR扩增和SCOTS对cDNAs选择和致病性特异转录序列的富集,致病性特异的cDNAs被分离鉴定,共获得31个转录序列(命名为aec),其中分别有2、1、4、14、2和8个aec序列与黏附素、LPS的合成、铁的摄取系统、质粒编码基因、噬菌体编码基因和一些其它功能基因相关;从气囊中分离到16个aec序列,心包膜中分离到15个aec序列;有3种与质粒编码基因相关序列在气囊和心包膜中都被分离到。结果显示APEC致病性特异序列包括黏附素、LPS的合成、铁的转运、质粒编码基因、噬菌体编码基因和一些其它功能基因等。通过SCOTS方法建立了一种体内表达致病性特异基因的方法和APEC在自然宿主感染模型中致病性相关基因的表达谱的筛选方法。     

大肠杆菌SLTIIvB基因的克隆和表达

采用聚合酶链式反应(PCR),从大肠杆菌O.138基因组DNA中分别扩增出志贺菌样毒素II型变体B的结构序列和包括信号肽的全序列两段基因,定向克隆进表达载体质粒pYA3334(asd\++)的EcoRI\,BamHI位点之间,构建成重组表达质粒。在大肠杆菌X6212(Δasd)筛选出重组质粒pB\-0和pB\-1后,经中间宿主X3730转化过渡,再导入ΔasdΔcyaΔcrp减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550,构建成宿主和载体之间具有平衡致死结构的SLTIIvB重组菌。SDSPAGE和Westernblot分析重组菌X4550(pB\-0)在76kD左右处有一条特异性蛋白条带。动物免疫试验表明该重组菌能刺激机体产生针对SLTIIvB和沙门氏菌的特异性抗体。这为进一步研制相应的抗猪水肿病及相应沙门氏菌病的双价活疫苗奠定了重要基础。     

利用转基因植物表达药用蛋白

随着药物生物技术和植物基因工程迅速发展 ,转基因植物被用作生物反应器生产具有医疗价值的多肽和蛋白质已成为生物医学研究的热点。研究表明转基因植物表达的蛋白质能够保持原有的结构和功能 ,这预示它将为药用蛋白的生产提供一条安全和廉价的新途径。主要概述了近年来国内外转基因植物生产诸如疫苗、抗体和其他药用蛋白或多肽等的研究进展 ,并着重探讨了存在的问题和解决策略。     

用小鼠模型分析表达牛结核分枝杆菌Ag85B重组腺病毒的细胞免疫特性

【目的】构建表达牛结核分枝杆菌抗原Ag85B重组腺病毒rAd-Ag85B,并用小鼠模型分析其细胞免疫特点。【方法】采用PCR方法,扩增结核分枝杆菌Ag85B的编码基因fbpB,测序后构建pDC516-Ag85B重组质粒。利用脂质体将pDC516-Ag85B与pBHGfrtΔE1,3FLP共转染Ad293细胞包装成重组病毒rAd-Ag85B。空斑纯化后用电镜负染、目的基因转录和蛋白表达进行rAd-Ag85B验证。同时将rAd-Ag85B和rAd(wtAd)分别经皮下注射免疫BALB/c小鼠,二免二周后取小鼠脾脏细胞,进行CD69表面分子表达、淋巴细胞增殖和ELISPOT实验分析。【结果】在电镜下能观察到包装的重组病毒粒子,且在转录和蛋白水平上验证了rAd-Ag85B构建成功。免疫试验结果显示,rAd-Ag85B能激活CD4+T和CD8+T细胞表面分子CD69的表达,并引起淋巴细胞增殖。ELISPOT表明rAd-Ag85B呈现Th1免疫特点。【结论】成功构建的rAd-Ag85B能引起机体针对PPD蛋白或Ag85B多肽的Th1免疫应答。