Bacillus sp. fmbJ224发酵产新型抗菌肽培养基的优化研究

采用Plackett-Burman设计(Plackett_Burman Design,PB) 法,对影响Bacillussp.fmbJ224产新型抗菌肽的17个因素进行了筛选。结果表明：影响该菌发酵产新型抗菌肽的主要培养基成分为葡萄糖、NH₄NO₃、谷氨酸、CaCl₂、MnSO₄。在此基础上,再采用响应曲面法(Response Surface Methodology RSM)对其5个显著因子的最佳水平范围进行研究。通过对二次多项回归方程求解得知,在上述自变量分别为葡萄糖8.13g/L、NH₄NO₃6.14g/L、谷氨酸4.2g/L、CaCl₂ 3.98mg/L、MnSO₄4.87mg/L时,新型抗菌肽的产量从1304.21μg/mL提高到了1487.58μg/mL。     

抗微生物脂肽体外抗PRV和PPV的研究

本试验研究了枯草芽孢杆菌fmbJ株产生的抗微生物脂肽(Antimicrobiallipopeptide,AMI)的体外抗伪狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus,PRV)、猪细小病毒(Porcineparvovirus,PPV)南京株活性并对其可能的机理进行了初步探讨。结果表明该抗微生物脂肽对猪肾(PorcineKidney,PK-15)细胞的半数中毒浓度(MedianToxicosisDose,TD50)和最大无毒浓度(TD0)分别为47.57mg/L、18.9mg/L;对PRV株、PPV南京株所致细胞病变效应(CytopathicEffects,CPE)有明显的抑制作用,可使细胞存活率显著升高;但不能抑制PRV株、PPV南京株在PK-15细胞上的感染和复制。由此可知,该抗微生物脂肽可以直接作用于PRV株、PPV南京株,从而抑制其对PK-15细胞的感染作用,其作用效果显著低于抗病毒药物阿昔洛韦(Acyclovir,ACV),但由于其对PK-15细胞毒性较弱,可作为一种抗病毒药物进行进一步开发研究。     

从人胃肠道源乳杆菌株中初步筛选耐酸耐胆盐优良株

目的筛选对酸和胆盐耐受性均较强的优良乳杆菌株。方法模拟人体胃酸环境（pH=3）和十二指肠高胆盐环境（胆盐含量=3‰）测定104株人胃肠道源乳杆菌在酸性及高胆盐环境下作用4h后的存活菌数,并与对照相比较。对结果进行统计学分析。结果16株菌在酸性环境及高胆盐环境下4h后的活菌下降对数值均小于2。筛选出3株具有较强耐酸耐胆盐能力的乳杆菌株。结论大多数人胃肠道源乳杆菌对酸和胆盐的耐受能力均不强,对酸的耐受性普遍强于对胆盐的耐受性。     

Bacillus subtilis fmbJ脂肽类抗菌物质的分离和鉴定

对Bacillus subtilis fmbJ脂肽类抗菌物质的分离和鉴定进行了系统研究。通过HPLC层析确定Bacillus subtilis fmbJ抗菌物质由多种组分构成,其中含有保留时间与surfactin相似的成分。通过TLC层析和原位酸解确定Bacillus subtilis fmbJ抗菌物质含有两个具有闭合肽键类的物质,其中之一为迁移率Rf与标样surfactin非常相近的组分。通过 ESIMS分析检测到Bacillus subtilis fmbJ抗菌物质含有分子量与fengicin相同的m/z1449.9、m/z1463.8、m/z1477.8、m/z1491.9和m/z1505.9五种同系物,和分子量与surfactin相同的m/z1008.8、m/z1022.8和m/z1036.8三种同系物。     

不同施肥处理对'秦美'猕猴桃贮藏性及其品质的影响

以秦美猕猴桃为材料,对不同施肥处理的果实后熟过程中软化、腐化过程进行观察统计,并在果实采后4个具有代表性的后熟时期(硬度分别为15 kg/cm2左右、8~7 kg/cm26、~5 kg/cm25、~4 kg/cm2)进行可溶性固形物、可滴定酸、Vc、可溶性糖等营养指标测定.结果显示:(1)从后熟过程中软化、腐化统计看,3个施肥处理(A、B、C)的贮藏品质与对照(CK)间差异明显,C处理(氮肥 磷肥 农家肥)的猕猴桃贮藏期最长,软化、腐化出现得最晚,较对照分别延长15 d、27 d,贮藏性最好;(2)3个施肥处理的营养指标与CK间差异明显,C处理与CK和A处理差异显著.表明在猕猴桃生产中采用氮肥 磷肥 农家肥相结合的施肥方式可显著延长猕猴桃果实贮藏期(后熟期),并可显著提高猕猴桃果实的食用和营养品质.     

Plantaricin 163对热杀索丝菌的抗菌活性及其作用机制

【背景】热杀索丝菌(Brochothrix thermosphacta)为鲫鱼在4°C贮藏过程中的主要腐败菌,Plantaricin 163是由植物乳杆菌产生的一种新型广谱细菌素,能明显延长鲫鱼的贮藏期。【目的】研究Plantaricin163对热杀索丝菌的抗菌活性和作用机制。【方法】通过测定最小抑菌浓度(Minimuminhibitoryconcentration)和杀菌动力学了解Plantaricin163对热杀索丝菌的抗菌效果,并从电导率的变化、核酸和蛋白的泄露、流式细胞实验、扫描电镜和透射电镜观察等4个方面探讨Plantaricin 163对热杀索丝菌的作用机制。【结果】Plantaricin 163对热杀索丝菌的的最小抑菌浓度为32μg/mL,优于Nisin的作用效果,作用方式为杀菌模式,6 h内能完全杀死热杀索丝菌。Plantaricin163能够通过增加热杀索丝菌细胞膜的通透性,增加胞外电导率,进而破坏细胞膜完整性,导致内容物泄漏,并影响细胞的外部形态和内部结构,从而导致菌体细胞瓦解死亡。【结论】Plantaricin 163可以破坏热杀索丝菌的细胞膜和内部结构,发挥抗菌活性。     

枯草芽胞杆菌fmbj SrfAC-A结构域的活性测定

[目的]在体外研究surfactin合成酶的A结构域,为获得新的surfactin类似物奠定基础.[方法]本文从枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)fmbj中克隆出surfactin合成酶第7个模块的A结构域基因(SrfAC-A),与表达质粒pET-23a相连后在大肠杆菌表达系统中表达,用Ni-NTA亲和柱对重组蛋白SrfAC-A进行分离纯化后测定其活性.[结果]克隆所得的A结构域对Ile有选择活性,而对其他氨基酸基本无活性.[结论]Surfactin合成酶中的A结构域能在体外独立行使其选择底物氨基酸的功能.     

人Notch1受体shRNA重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:构建人特异性受体Notch1短发夹RNA重组腺病毒载体,探讨其对人脐带间充质干细胞中Notch1表达的影响,以便进一步研究Notch1的生物学功能.方法:设计合成Notch1序列干扰序列,插入到pGenesil-1.1上构建重组质粒,取阳性克隆进行酶切及DNA测序鉴定.通过同源重组,构建含目的基因的重组腺病毒质粒栽体pGsadeno-Notch1-shRNA.经PacI线性化后脂质体介导转染到HEK 293细胞,包装后得到腺病毒颗粒.产生的重组腺病毒体外转染人脐带间充质千细胞,RT-PCR和Western blot 检测特异性shRNA对人脐带间充质干细胞中Notch1蛋白在mRNA及蛋白表达水平的抑制效果.结果:经酶切及DNA测序重组腺病毒质粒构建正确.重组腺病毒转染人脐带间充质干细胞3d后,RT-PCR及Western blot检测,可显著下调细胞内Notch1的转录及蛋白表达水平.对Notch1 mRNA和蛋白表达的抑制率分别为70.31％和86.97％,具有统计学意义(P＜0.05).结论:成功构建了表达人Notch1受体shRNA的重组腺病毒载体,为研究Notch1在肿瘤学中的生物学作用及机制奠定基础.     

水土保持林恢复土壤可溶性碳氮组分动态与三维荧光特征分析

为探究水土保持林恢复过程中土壤可溶性碳氮含量变化及其有机组成特性,揭示水保林土壤固存可溶性有机质的效应及机制。选取了黄土丘陵区恢复12-45a的人工柠条、刺槐林以及撂荒地,分析了土壤可溶性碳氮含量及其三维荧光光谱特征与特性参数的动态变化。结果表明：随恢复年限的增加,3种植被土壤可溶性有机碳（DOC）、有机氮（DON）、无机氮（DIN）的含量均呈增加趋势,并且相同恢复年限下DOC、DON、DIN含量总体表现为撂荒 < 柠条 < 刺槐;但柠条和刺槐林土壤DOC：DON及二者占总有机碳、全氮比例并未持续增加,到恢复45a时DOC占总有机碳比例以及DOC：DON均以撂荒地最高,刺槐林最低,DON占全氮比例则表现相反。三维荧光结合平行因子分析得出所有样地土壤可溶性有机质（DOM）主要有大分子腐殖物质（C1）、低分子量类富里酸（C2）、类色氨酸（C3）及农业措施输入的腐殖物质（C4）4个组分,并且以C1组分占比最大,平均达37.4%。随恢复年限增加,3种植被土壤DOM中C3组分占比升高,C2和C4组分占比降低,C1组分占比在柠条和刺槐林中升高,在撂荒地中则降低。不同植被土壤可溶性有机质荧光指数（FI）、新鲜度指数（β：α）及自生源指数（BIX）差异不显著,分别为1.63、0.58、0.59;不同恢复年限撂荒地腐殖化指数（HIX）没有差异,但柠条和刺槐林显著高于撂荒且随恢复年限增加先增大后稳定。综上,水保林持续恢复可以显著提升土壤可溶性碳氮含量,也使土壤可溶有机质组成趋向复杂和相对稳定,利于累积固持,特别以刺槐林效应最明显。     

内生多粘类芽胞杆菌纤溶酶基因PPFE-Ⅰ在大肠杆菌中融合表达及活性分析

以内生多粘类芽胞杆菌EJS-3基因组DNA为模板,PCR扩增PPFE-Ⅰ基因,并克隆到pMD19-T载体上,构建克隆载体pMD-PPFE-Ⅰ,经测序正确后,将PPFE-Ⅰ基因克隆至表达载体pET-DsbA上构建重组表达质粒pET-DsbA/PPFE-Ⅰ,将其转化至E.coli BL21(DE3),在IPTG诱导下实现了融合蛋白DsbA-PPFE-Ⅰ的表达,表达产物酶活性达228 IU/mL.表达产物用SDS-PAGE和Western blotting进行鉴定.SDS-PAGE电泳检测表明融合蛋白主要以可溶形式表达,占菌体总蛋白的18.4%.Western blotting结果表明在相应分子量处有一条特异性条带,证实该蛋白为DsbA-PPFE-Ⅰ融合蛋白.表达产物通过Ni亲和柱、凝血酶酶切及Scphadex G-100等步骤进行分离纯化,并用MALDI-TOF质谱对重组酶进行了鉴定.纯化后的表达产物在纤维蛋白平板上表现出明显的纤溶活性.