MicroRNA调控动物脂肪细胞的分化

MicroRNA (miRNA)属于非编码小调节RNA,在动物细胞的增殖、分化、凋亡和代谢等许多生物学过程中具重要作用.研究显示大量miRNA也参与动物脂肪细胞的分化调节,在前体脂肪细胞向成熟脂肪细胞的分化过程中具有多种功能.目前的研究结果表明,这些miRNA在脂肪细胞分化的早期或后期通过其靶基因发挥功能,如miR-17-92和miR-143分别通过其靶基因Rb 2/p 130和ERK 5/BMK 1调节脂肪细胞分化,过表达可促进体外培养的脂肪细胞分化.因此,了解更多miRNA在脂肪细胞分化中的功能,可以加深对动物脂肪形成分子机制的理解,并有可能将其作为脂类代谢性疾病治疗的潜在靶点.     

MiR-125a-5p抑制3T3-L1前体脂肪细胞分化

MicroRNAs(miRNAs) 是一类在脂肪组织发育中发挥重要作用的小非编码RNA. 为探明miR-125a-5p在3T3-L1前体脂肪细胞中的作用,采用实时qPCR检测了miR-125a-5p在小鼠各组织及3T3-L1前体脂肪细胞分化过程中的表达|使用经化学修饰的miR-125a-5p模拟物agomir及抑制剂antagomir转染3T3-L1前体脂肪细胞,采用实时qPCR 和 Western印迹检测成脂标志基因Pparγ和aP2的表达,油红O染色观察脂肪细胞脂质积累. 结果显示,miR-125-5p在小鼠脂肪组织中高丰度表达,在3T3-L1前体脂肪细胞分化过程中表达下降.过表达miR-125a-5p,与对照组相比,成脂标志基因Pparγ和aP2在mRNA和蛋白质水平均明显下降|油红O染色及定量结果显示脂质积累减少. 抑制剂处理结果显示,Pparγ和aP2在mRNA和蛋白质水平均有不同程度上升,但油红O染色及定量结果差异不显著. 以上结果表明,miR-125a-5p在脂肪细胞分化中发挥负调控作用.     

干扰Sema7A抑制C2C12成肌细胞的增殖和分化

为研究脑信号蛋白家族（Semaphorins）成员Sema7A对成肌细胞增殖和分化的影响,本文设计并合成了Sema7A基因的小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）,用此siRNA转染C2C12成肌细胞．通过Hoechst核染和流式细胞术检测细胞增殖情况,免疫荧光检测肌管的形成情况,real-time qPCR和Western印迹技术检测成肌标记基因的变化.结果显示,干扰Sema7A后,C2C12成肌细胞增殖减慢,处在G2和S期的细胞所占的比例明显下降,而G1期细胞的比例升高．免疫荧光检测结果显示,干扰Sema7A后,肌管的直径及MyHC+细胞所占比例均显著降低．Real-time qPCR和Western印迹结果也显示,肌肉分化标志基因MyoD、MyoG、MyHC的mRNA及蛋白质表达均下降．进一步检测Sema7A受体下游信号通路发现,干扰Sema7A后,其下游信号分子PI3K和AKT的磷酸化水平被下调．以上结果表明,Sema7A可以调节C2C12成肌细胞的增殖和分化,可能是通过其受体作用于PI3K/AKT信号通路实现的,这为进一步研究Sema7A在骨骼肌发育中的作用提供实验基础.     

脂肪组织RNA提取方法的改进

本试验以猪脂肪组织为材料,应用TRIzol、V-gene、H.Q＆.Q三种总RNA提取试剂盒分别提取脂肪组织RNA,发现直接按照试剂盒说明书操作提取的RNA效果不理想.通过反复试验,分别改进了提取过程中的部分操作步骤,结果表明：三种试剂盒操作方法改进后与改进前相比,提取RNA的纯度和得率表现为差异极显著（P＜0.01）;三种试剂盒操作方法改进后提取RNA的纯度差异不显著（P＞0.05）,但在得率方面,Trizol比其它两种高,表现为差异极显著（P＜0.01）.三种试剂盒操作方法改进后提取的RNA经RT-PCR扩增猪β-actin基因,电泳结果显示,扩增条带清晰、特异,说明提取的RNA完全符合后续的分子生物学实验要求.     

羊草种质基因组DNA的AFLP多态性研究

羊草是禾本科牧草之王,在当前我国西部生态建设和草原畜牧业发展中发挥着重要作用.用AFLP方法对27份我国不同地区分布的羊草(Leymus chinensis (Trin.) Tzvel)材料进行了基因组DNA多态性分析,8对AFLP引物组合在27个不同羊草基因型中共扩增出537条带,产生出的DNA片段大小分布在75 bp-530 bp之间.其中单态性带89条,占16.6%,多态性带329条,占61.3%.平均每对引物组合扩增的DNA带数为66.13,总的多态性比率为78.84%.AFLP多态信息含量PIC值分布于0.0-0.5之间,平均PIC值为0.216,出现的PIC最大值(0.5)约占AFLP标记的8.5%,说明羊草基因组DNA的多态性比较丰富.以537个AFLP标记为原始数据,根据Nei和Li的方法对27份羊草材料进行遗传变异和聚类分析的结果表明:羊草种内有高频率的遗传变异发生,且与地理分布和生态环境密切相关;27份羊草不同基因型被划分为四大类群,不同类群相互间的遗传距离相对较大,在树状图中表现为较远的亲缘关系.对羊草种内遗传变异发生的原因和品种的形成进行了初步讨论.     

外源性瘦素通过丝裂素活化蛋白激酶抑制猪骨骼肌成肌细胞分化

研究瘦素(leptin)对猪骨骼肌成肌细胞分化的影响, 并探讨其可能的作用机制。原代培养猪骨骼肌成肌细胞, 通过倒置显微镜定性观察细胞分化的形态学变化; 肌酸激酶(CK)活性测定法定量分析成肌细胞分化程度; 细胞免疫化学方法分析myogenin的表达情况; 免疫印迹技术(Western Blot)检测丝裂素活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)的表达变化。结果显示, 在猪骨骼肌成肌细胞分化过程中, 外源性leptin减少细胞核融合和肌管形成, 呈浓度和时间依赖性地显著降低CK活性( P < 0.05), 并显著抑制myogenin和MAPK的蛋白表达( P < 0.05)。以上结果说明, leptin抑制猪骨骼肌成肌细胞分化, 并且这种作用可能是通过激活MAPK 信号转导通路实现的。研究结果显示, leptin在骨骼肌成肌细胞分化过程中可能具有重要作用。     

猪脂肪组织发育过程中Wnt/β-catenin信号通路相关基因及脂肪转录因子的时序表达

为研究Wnt/b-catenin信号通路对猪脂肪组织发育的影响, 并探讨其可能的作用机制, 以1~120日龄长白猪脂肪组织为试验材料, 采用SQ RT-PCR法检测Wnt信号通路中相关基因β-catenin、GSK3β、Fz1及主要的脂肪转录因子PPARγ、C/EBPα 和分化早期标志基因LPL mRNA的表达变化; 石蜡切片免疫组化方法定性检测β-catenin在脂肪组织发育中的时序表达变化。SQ RT-PCR结果显示, β-catenin mRNA在猪出生第1天有高水平表达, 随着个体日龄的增长, 其表达量逐渐降低, 60日龄后维持在一个较低水平。GSK3β和Fz1 mRNA的表达量也伴随脂肪组织的发育而逐渐降低。而LPL、PPARγ和C/EBPα的 mRNA表达量随着个体日龄的增长而逐渐升高, 60日龄后仍保持高水平的表达。石蜡切片免疫组化结果显示, 随着脂肪组织的发育, β-catenin蛋白的表达也随之降低, 并且β-catenin蛋白的表达部位逐渐由细胞核和细胞质共表达变为只在细胞质中表达。上述基因表达的时序变化规律提示, β-catenin在维持前体脂肪细胞的未分化状态, 抑制脂肪组织发育中具有重要作用, 其作用机制可能是通过对脂肪细胞转录因子PPARγ、C/EBPα及分化早期标志基因LPL mRNA的调控来进行的。     

不同猪品种肌肉组织FoxO1与MyoD基因mRNA的表达及其相关性分析

分别取6月龄八眉猪、长白猪和长×八杂交猪背最长肌,提取总RNA,设计并合成猪FoxO1和MyoD 引物,以β肌动蛋白作为内参,优化反应条件和体系,利用RT-PCR方法检测八眉、长白和长×八杂交猪肌肉组织中FoxO1和MyoD基因mRNA 的表达.结果表明,在不同经济类型猪品种肌肉组织中,FoxO1和MyoD基因mRNA的表达丰度均存在显著差异,FoxO1在八眉猪肌肉组织中的表达普遍高于长白猪（P<0.01）,在杂交组合长×八肌肉组织中的表达也高于长白猪（P<0.01）;而MyoD恰好相反,即在长白猪肌肉组织中的表达普遍高于八眉猪（P<0.01）,在杂交组合长×八肌肉组织中的表达也高于八眉猪（P<0.01）．结果提示,FoxO1和MyoD基因mRNA的表达在肌肉发育中存在负相关（r = 0.728 , P < 0.05）,FoxO1在肌肉组织中的上调作用,可能是造成的MyoD基因mRNA表达降低的原因之一,进而负调控肌肉的发育和骨骼肌的量．     

猪Wnt10b基因cDNA的克隆及生物信息学分析

Wnt10b是Wnt转录因子家族成员之一,是一种胞外信号分子,它通过一系列复杂信号通路调控胚胎发育、干细胞定向分化等生理过程.根据NCBI公布的wnt10b基因序列在保守区内设计引物,利用降落PCR法扩增猪Wnt10b基因,所得序列提交GenBank,登录号EU181371.核酸序列分析结果显示,该基因编码394个氨基酸,与人、小鼠、大鼠、牛和马等核苷酸序列比对,同源性分别为94%、89%、89%、92%和93%,氨基酸同源性分别为98%、96%、96%、94%、98%和97%.揭示该基因在不同物种间具有高度保守性.     

向日葵分子生物学研究进展

向日葵是一种营养价值极高的资源植物,向日葵的研究和生产在当前我国中西部大开发的战略中具有重要的意义。本文对近年来国内外向日葵分子生物学研究的最新进展,在蛋白质、酶、基因及基因工程、分子标记等方面进行了综述。特别对生化标记、分子标记技术在向日葵研究上的应用及所取得的成果作了重点介绍,并对今后向日葵研究工作进行了展望。