产聚羟基脂肪酸酯细菌的筛选与鉴定

【目的】聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates,PHAs)是一种生物可降解的天然高分子聚酯,本研究的目的是从广东省某啤酒厂废弃的活性污泥中分离筛选PHAs产生菌。【方法】首先,从活性污泥中分离PHAs产生菌。分离方法分3步:(1)富集培养PHAs产生菌;(2)通过苏丹黑B染色法进行初筛;(3)挑选PHAs产量较高的菌株,然后对细胞内提取产物进行分析,最后通过生理生化试验和16SrRNA基因序列分析法对该菌株进行鉴定。【结果】从广东省某啤酒厂的活性污泥样品中筛选获得PHAs产生菌HG-B-1,被鉴定为嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophlia)。细胞染色分析、胞内提取物的红外光谱分析表明HG-B-1胞内贮藏物为PHAs。该菌株在以蔗糖为碳源、牛肉膏为氮源的发酵培养基中,37℃振荡培养24h,PHAs产量可达细胞干重的23.4%。【结论】本文从广东省某啤酒厂的活性污泥中筛选得到PHAs产生菌,获得了一株新型的PHAs产生菌,为进一步研究和开发新型的PHAs产生菌提供了菌源和基础资料。     

红豆杉细胞稳定生产紫杉醇中的同步化协同诱导作用

同步化协同诱导可以稳定提高曼地亚红豆杉细胞培养物中紫杉醇含量。细胞培养周期第8d的低温同步化处理可促使细胞达到最高同步化率（20.4%）,而茉莉酸甲酯（MJ）的协同诱导可提高紫杉醇产量,使紫杉醇产量最高值达到54.7mg·L^-1。在细胞生长周期第8d,未经低温同步化的红豆杉细胞中的关键酶基因DXR、HMGR、GGPPS和DBAT的表达量在MJ诱导24h后均迅速下降,但在低温同步化的细胞中紫杉醇表达量下降缓慢,60h后仍维持较高的水平。低温同步化和MJ协同诱导的红豆杉细胞中,紫杉醇合成关键酶基因高效稳定的表达可能是引起紫杉醇产量稳定提高的原因之一。     

狂犬病病毒SRV_9突变株的构建与拯救

为构建人工修饰的狂犬病病毒,首先用人细胞色素C基因替换狂犬病病毒SRV9株基因间隔区中的非必需区域Ψ区并缺失基因组全长cDNA的糖蛋白CD编码区,得到突变型SRV9cDNA质粒。然后,该质粒与表达野生型SRV9四种结构蛋白N、P、G和L的质粒共转染BHK-21细胞。免疫荧光试验显示转染细胞中有大量特异性荧光,电子显微镜观察可见大量典型的狂犬病病毒粒子。上述结果表明已成功地拯救出了人工修饰的狂犬病病毒。狂犬病病毒SRV9突变株的成功构建与拯救,为新型狂犬病减毒活疫苗的研究提供了重要的实验工具。     

不同温度和光照度下以及收集时间内茄子根系分泌物量

在温度为25℃、光照度为300μmol·m-2·s-1的条件下,收集时间为5 h的茄子根系分泌物的量最大.     

杜氏盐藻随机MAR文库的构建

核基质附着区(Matrixattachmentregion,MAR)是一段与核基质结合的DNA序列。为分离杜氏盐藻核基质附着区,我们首次构建了杜氏盐藻MAR文库。首先用0.5%TritonX-100裂解细胞,经30%和70%Percoll不连续梯度离心分离盐藻细胞核,再用二碘水杨酸锂(lithiumdiiodosalicy-late,LIS)去除组蛋白和限制酶消化除去结合松弛的DNA片段,最后通过蛋白酶K消化和乙醇沉淀提取盐藻核基质DNA。采用4种限制酶酶切,T_4DNA连接酶连至用相应限制酶酶切的pUC18载体上,转化E.coliJM109感受态细胞,挑选阳性克隆,构建MAR文库。部分测序分析表明,克隆的DNA片段具有明显的MAR特征。为进一步研究MAR对基因表达的调控作用及其作用机制提供了基础。     

糖耐量减低患者血清瘦素与内皮素-1的测定及其临床意义

目的：探讨糖耐量减低（IGT）患者血清瘦素（Leptin）和血浆内皮素-1（ET-1）含量变化及其意义。方法：采用放射免疫法检测65例IGT患者、50名正常健康体检者和50例2型糖尿病患者血清中Leptin和ET-1的含量,同时分别测定体重指数、腰臀比、空腹血糖（FBG）、餐后2小时血糖（2h PBG）及空腹胰岛素（FINS）,并用HOMA稳态模型计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）。结果：糖尿病组、IGT组血清Leptin、ET-1、FBG、2hPBG、FINS、TC含量及HOMA-IR指数显著高于正常对照组（P〈0.05）,糖尿病组血清Leptin、ET-1、FBG、2hPBG、FINS、TC含量及HOMA-IR指数明显高于IGT组（P〈0.05）。IGT组血清Leptin水平与BMI、血清ET-1、FBG、2hPBG、FINS、TC含量及HOMA-IR指数呈显著正相关（P〈0.01）,IGT组血清ET-1水平与收缩压、舒张压、BMI、血清FBG、2hPBG、FINS含量及HOMA-IR指数呈显著正相关（P〈0.01）。结论：瘦素与内皮素-1均可能在IGT发展成2型糖尿病过程中起一定的作用。     

小鼠canstatin C端片段基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

为了构建小鼠canstatinC端片段的原核表达载体并在大肠杆菌中表达。以小鼠肝脏组织总RNA为模板,通过RT-PCR扩增小鼠canstatinC端片段(mCan-C)基因,克隆到pMD18-T载体中并进行序列分析。将mCan-C基因定向克隆于原核表达载体pET30a(+)中,构建表达载体pET／mCan-C,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。结果表明,小鼠canstatinC端片段的cDNA长度为399bp,含有1个终止密码,编码132个氨基酸,与已知的人canstatinC端片段氨基酸的同源性为61％。IPTG诱导mCan-C在大肠杆菌E．coliBL21中表达,表达量约占菌体总蛋白量的28％,重组蛋白主要以包涵体形式存在。首次克隆了小鼠canstatinC端片段的cDNA,IPTG诱导mCan-C在大肠杆菌E．coliBL21中高效表达。小鼠canstatinC端片段的cDNA序列已收入GenBank,接受号为:AY502947。     

人类新基因cegl cDNA的克隆及表达研究

CLECT and EGF-like domain contained Gene 1(cegl)基因是用电子克隆的方法获得的人类新基因。该基因定位在人类的第14号染色体上,是一个单一外显子的基因。cegl基因的cDNA长度为2050bp,通过生物信息学方法预测它包含一个1340bp的完整阅读框架,编码一个490个氨基酸的蛋白,含有CLECT、EGF-like结构域各一个。以cegl基因全长编码区为探针的整体原位杂交结果显示该基因的小鼠和鸡的同源基因在各自早期胚胎头部中特异表达,并且在不同时期胚胎神经系统增殖迅速的部位中有大量的表达。RT-PCR结果显示该同源基因在小鼠成体各组织中广泛分布。这提示cegl基因可能与头部生长发育有密切关系,并且对维持成体各组织的正常功能起到重要的作用。对cegl基因在胚胎发育的时间和空间表达模式的研究将有助于进一步深入地揭示它在人脑的正常生长发育中的作用。     

小反刍兽疫病毒N蛋白原核表达条件的优化及反应活性

目的 探讨小反刍兽疫病毒（Peste des Petits Ruminants Virus,PPRV）N蛋白原核表达、条件优化及反应活性。方法 参照GenBank中PPRV(Nigeria/75/1)N基因序列,人工合成该基因,构建重组表达质粒pET-30a(+)-N,转化至BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE电泳、Western-blot分析。在不同温度、时间、IPTG浓度条件下诱导表达N蛋白,确定最佳表达条件。结果 PPRV N蛋白（64.4 kD）成功表达,能被羊PPRV免疫血清所识别。N蛋白主要以包涵体存在,其最佳诱导条件：诱导温度28℃、IPTG终浓度2.0 mmol/L、诱导时间16 h。结论 原核表达的PPRV N蛋白具有良好的特异性和反应活性,为单克隆抗体的制备及快速诊断方法的建立提供了技术资料。     

抗c-Myc标签纳米抗体的筛选与应用

目的: 以c-Myc-GST蛋白为靶分子,从纳米抗体噬菌体展示免疫文库中筛选能够特异性识别c-Myc标签(EQKLISEEDL)的纳米抗体。方法: 采用固相淘选技术,筛选出能与c-Myc标签特异性结合的噬菌体,phage-ELISA鉴定阳性克隆并测序,通过基因重组技术将阳性噬菌体编码的纳米抗体基因克隆至原核表达载体pET25b(+),再转化至大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析重组蛋白表达情况。采用间接ELISA和量子点免疫荧光法验证纳米抗体的结合活性和特异性。结果: 通过4轮固相淘选,具有结合活性的噬菌体克隆得到了有效富集,回收率提高了145倍,阳性率从20.83%提高至85.4%。将phage-ELISA鉴定显色值高的两个纳米抗体A25和A26分别进行了重组表达,SDS-PAGE结果显示均为可溶性表达,表达量为60 mg/L。间接ELISA结果表明重组蛋白A25和A26都能够识别c-Myc标签,量子点免疫荧光法验证得到纳米抗体A25能够对SP2/0细胞内的c-Myc蛋白进行检测。结论: 成功地筛选出与c-Myc标签结合的纳米抗体噬菌体克隆,构建了两个抗c-Myc标签纳米抗体的原核表达载体并实现了可溶性表达,为检测胞内c-Myc蛋白奠定了基础。