卵周隙内注射慢病毒生产转基因绵羊的方法

目的提高并稳定转基因绵羊生产效率。方法采用卵周隙内注射慢病毒的方法生产转基因绵羊。比较了不同发育阶段卵母细胞注射慢病毒对其后期发育及基因表达的影响,对照了注射不同慢病毒剂量以及不同熟练程度人员操作,对胚胎发育及基因表达率的影响。结果 (1)受精前或受精后注射慢病毒对胚胎后期发育和阳性率没有影响(P>0.05);(2)在受精后的单细胞注射或者2～4细胞期注射慢病毒对胚胎后期发育和阳性率也都没有影响(P>0.05);(3)慢病毒注射剂量在50～100 pL之间对转基因效率没有影响(P>0.05);(4)操作人员的熟练程度不影响胚胎成活率和转基因效率(P>0.05)。结论建立了卵周隙内注射慢病毒生产转基因绵羊的方法,并使转基因胚胎阳性率稳定在70%以上。     

牛卵母细胞玻璃化冷冻对基因mRNA表达量的影响

目的 将处于生发泡期(GV期)和体外成熟期(IVM)的牛卵母细胞进行玻璃化冷冻.解冻,对其卵裂率和囊胚率以及一些与发育相关基因的mRNA表达量进行评价.方法 玻璃化冷冻GV期(n=224)和IVM期(n=235)牛卵母细胞,解冻后对其进行体外培养并采用quantitative real time-PCR技术对冷冻.解冻...     

3种药物对老化卵母细胞4种母源mRNA水平的影响

利用Real-Time PCR技术定量分析了绵羊(Ovis aries)卵母细胞在生长-成熟-老化过程4种母源mRNA(Mater、Zar1、Dnmt1、GDF9)发生的动态变化,以及3种药物(咖啡因、DTT和矾酸盐)对老化卵母细胞母源mRNA水平的影响。结果显示,除Dnmt1在12 h开始下降外,卵母细胞中其他3个基因的表达量都是从生发泡期逐渐下降,且在体外培养至24 h降到最低,然后随着卵母细胞的老化又逐渐上升。其中GDF9和Mater 2个基因在30 h组的卵母细胞中的表达量显著高于24 h组卵母细胞(P0.05)。30 h卵母细胞中Zar1和Dnmt1的转录水平与24 h卵母细胞差异不显著(P0.05)。除Zar1外,咖啡因和DTT都显著降低了老化卵母细胞中其他3个基因的表达量(P0.05),且所有基因表达量与24 h组卵母细胞差异不显著(P0.05)。矾酸盐处理后的卵母细胞其4种母源mRNA水平都是最高,除Zar1外其他3个基因表达量都显著高于24 h组(P0.05)。结论是,Mater、Zar1、Dnmt1、GDF9 4种母源mRNA水平与卵母细胞质量成反比,咖啡因和DTT能在一定程度上延缓卵母细胞的衰老,改善卵母细胞质量;而矾酸盐则加速了卵母细胞老化进程,降低了卵母细胞质量。     

抗坏血酸、表皮生长因子和促卵泡素对绵羊卵巢皮质体外培养的影响

本研究旨在评估抗坏血酸(VC)、表皮生长因子(EGF)、促卵泡素(FSH)对绵羊原始卵泡体外培养的影响以及它们之间的相互关系。实验按照2×2×2因子试验设计分为8组,分别为:MEM(对照组),MEM+VC(50μg/mL),MEM+EGF(100ng/mL),MEM+FSH(50ng/mL),MEM+VC+EGF,MEM+VC+FSH,MEM+EGF+FSH,MEM+VC+EGF+FSH。在培养0(未培养对照组)、2、6、12d后,对培养的卵巢皮质薄片进行组织学和增殖细胞核抗原(PCNA)检测以及透射电镜(TEM)观察。结果表明,与未培养组(发育卵泡比例15.4%±1.9%,正常卵泡比例88.2%±4.6%)比较,所有培养组中发育卵泡比例显著增加(P0.05),正常卵泡比例下降(P0.05)。培养12d后,与对照组(卵泡直径(34.5±3.3)μm,卵泡存活比例(38.9%±3.9%))比较,MEM+VC+FSH和MEM+EGF+FSH组中卵泡直径(分别为(39.7±3.4)μm和(42.5±5.1)μm)和卵泡存活比例(分别为58.5%±4.3%和59.3%±3.7%)都显著提高(P0.05);各处理组中,培养12d后,MEM+VC+EGF组中发育卵泡比例(49.3%±3.2%)和卵泡直径((32.3±2.3)μm)最低,颗粒细胞PCNA阳性卵泡比例(26.4%±1.2%)也最少,而MEM+VC+EGF+FSH组中卵泡存活率(59.7%±6.1%)和卵泡直径((42.5±5.1)μm)都显著增加(P0.05),颗粒细胞PCNA(43.5%±4.1%,P0.05)表达增加。电镜结果表明,VC+EGF+FSH组能够维持与正常卵泡类似的超微结构,而在MEM和MEM+VC+EGF组却显示不同程度的退化特征。本研究结果提示在培养中联合添加VC与EGF抑制卵泡的发育和生长,而联合添加VC、EGF和FSH可能是促进绵羊原始卵泡体外激活和生长,维持卵泡存活以及结构完整的最有效的处理手段之一。     

绵羊类胚胎干细胞长期培养中增殖、凋亡、多能性相关基因的表达动力学

已报道的家畜类胚胎干细胞(embryonic stem-like cell, ESC-like)均无法实现长期培养,这制约了家畜ESC的研究．通过检测本实验室建系的绵羊类胚胎干细胞oESC-like,探究导致oESC-like无法持续培养的原因,为以后的研究打下基础. 实验观察了oESC-like形态变化,检测了AKP的表达,使用免疫荧光技术检测了PCNA、Bcl-2、Bax、Sox-2、Oct-4蛋白的表达,并用软件Image-Pro Plus 60计算蛋白表达水平．结果显示,oESC-like在长期培养过程中其形态具备ESC的典型形态特征;AKP持续表达;Sox-2和Oct-4的表达有不同程度的提高,增殖能力无明显变化;Bax表达水平逐代提高,Bcl-2的表达水平在5、10代显著高于Bax的表达水平可抑制Bax的活化,而从15代开始Bcl-2表达水平下降,低于Bax的表达水平,不能有效地抑制Bax的活化;Bcl-2/Bax表达水平的比值逐代下降,说明oESC-like在长期培养过程中逐渐走向凋亡.为解决绵羊类胚胎干细胞能够体外长期培养的科学问题,针对本实验室已有研究成果和存在的问题,进行逆向思维找出突破口,为遗传育种、基因工程、医疗等方面在实践上提供理论基础.     

bFGF浓度对oESC-like增值、凋亡、多能性相关基因表达的影响

使用免疫荧光技术检测与增值、凋亡、多能性相关基因的表达水平。提高bFGF浓度可增强PCNA、Oct-4、Sox-2、Bax和Bcl-2的表达,同时使Bcl-2/Bax比值维持较稳定水平。结果表明提高bFGF浓度可增强oESC-like的增值能力和多能性,增强其抗凋亡能力以适应长期培养。