应用改构的炭疽毒素作为靶向肿瘤细胞的药物递送系统及其效果评价

目的:通过改造炭疽毒素保护性抗原Protective Antigen (PA)及致死因子Lethal Factor (LF),尝试建立更加广谱的新型炭疽毒素靶向给药系统并对其递送效率进行定量评价.方法:采用基因工程手段,分别构建了3种改构的天然炭疽毒素保护性抗原PA及炭疽毒素的LF N端融合海肾荧光素酶(Luciferase)的LFn-linker-Luc的大肠杆菌重组表达体系.利用CCK-8法评价改构PA和LF共同作用肿瘤细胞后的细胞存活率;利用改构PA和LFn-linker-Luc与肿瘤细胞共孵育,通过测定细胞内荧光素酶活性,评价改构PA靶向肿瘤细胞的效果.结果:体外酶解实验证明构建的改构PA蛋白能够被正确地酶解成目的大小的片段;改构PA和LF共同作用肿瘤细胞能够显著降低细胞存活率;利用LFn-linker-Luc能够评价改构PA的靶向效率,PA蛋白的改构方式与其递送效率相关.结论:设计并改构的炭疽毒素药物递送系统,能够实现特异性靶向肿瘤细胞的效果,并具有更广谱的作用效果,为研制新型广谱抗肿瘤药物提供了新的思路和方法.     

不同发育期贝居腹盾吸虫体内乙酰胆碱酯酶分布特征

乙酰胆碱酯酶(ACh E)被证明存在于多种吸虫体内,但是关于ACh E在吸虫发育过程中的分布变化情况却少有报道。本实验以贝居腹盾吸虫(Aspidogaster conchicola)为研究对象,选取不同发育阶段的虫体,分别采用醋酸洋红染色和乙酰胆碱酯酶组织化学染色方法,对比处于不同发育阶段虫体的正常结构及乙酰胆碱酯酶分布特征,了解乙酰胆碱酯酶在吸虫发育过程中的分布变化规律。结果显示,从河蚌(Anodonta woodiana)体内获得的虫体根据内部器官的发育程度,可以分为4个不同发育阶段,即幼虫阶段Ⅰ、幼虫阶段Ⅱ、成虫阶段Ⅰ、成虫阶段Ⅱ。乙酰胆碱酯酶的分布在不同发育阶段存在着明显差异,幼虫阶段Ⅰ的睾丸及阴茎囊基部最先出现乙酰胆碱酯酶阳性反应,幼虫阶段Ⅱ在子宫末段膨大部位出现阳性反应;成虫阶段Ⅰ的卵黄腺、输卵管出现阳性反应,并且随着虫体的发育上述部位的阳性反应逐渐加强。而该吸虫的附着、消化、排泄器官在发育早期即出现较强的阳性反应,并伴随虫体发育全过程。该吸虫的神经系统在幼虫早期既已具备脑神经节、主要神经干等结构,而完整、复杂的中枢神经结构至成虫阶段才得以清晰显现。结果表明,乙酰胆碱酯酶的分布区域及反应程度随着虫体的发育而出现变化。     

入侵植物马缨丹研究进展

马缨丹原产于热带美洲,现已扩散至世界热带和亚热带地区,并严重威胁入侵地本地植物的生长。马缨丹因具有观赏价值而被我国大量引进,但由于疏于管理,发展成为入侵杂草,对我国农业、畜牧业及生态环境造成严重危害。目前对马缨丹的入侵机制还没有全面系统的认识。本文从马缨丹的生物学特性、入侵机制、生态学效应、防治与应用等方面进行综述,总结其研究进展,以期为马缨丹的防治工作提供依据。研究结果显示:马缨丹成功入侵的关键因素源于其独特的生物学性征;对农林业造成的危害的原因主要为它的化感作用;马缨丹的防治方法主要包括物理、化学和生物防治;马缨丹在防虫除虫、污染修复、药用价值等方面有所应用。此外,分析当前研究中的不足后发现,今后应加强马缨丹在自然环境中的适应机制、应用潜力、防治方法等的研究。     

利用合成的基因回路实现细胞水平上尿酸稳态控制的实验研究

目的:利用合成生物学方法构建尿酸介导的基因回路,在细胞水平上研究回路对尿酸稳态的调控作用。方法:以耐辐射异常球菌R1基因组中转录抑制物基因hucR及其结合位点基因hucO为基础,化学合成具有转录抑制功能的基因mUTs及其结合位点的8串联结构hucO8,构建基因回路;转染HeLa细胞,通过检测分泌型碱性磷酸酶(SEAP)的表达量来验证回路的作用原理和对尿酸的感应作用;在此基础上,用优化的黄曲霉菌尿酸氧化酶(Uox)基因smUox替换SEAP基因,转染HeLa细胞,通过检测转染前后培养基中尿酸浓度的变化,验证回路对尿酸的调节作用。结果:分别构建了优化的转录抑制物表达载体pcDNA3.1/V5-mUTs、报告基因表达载体pSEAP-hucO8、优化的黄曲霉菌Uox表达载体phucO8-smUox、pBudCE4.1-smUox,双向共表达载体pBudCE4.1-SEAP-mUTs、pBudCE4.1-mUTs-smUox;单独转染pBudCE4.1-SEAP-mUTs或共转染pSEAP-hucO8和pcDNA3.1/V5-mUTs,通过检测培养基中SEAP的表达量,证明双载体及单载体回路对尿酸的感应作用;用smUox替换SAEP基因后,通过检测转染48 h后培养基中尿酸含量的变化,证明双载体及单载体基因回路均具有一定的尿酸调节能力。结论:在细胞水平上,构建的双载体基因回路(phucO8-smUox、pcDNA3.1/V5-mUTs)和单载体基因回路(pBudCE4.1-mUTs-smUox)均可实现对尿酸的感应及调控作用,在一定范围内通过增加mUTs与hucO8的摩尔比,可以改变回路对尿酸的调控范围及调节程度。     

利用Bio-BglBrick方法表达紫杉醇生物合成酶

目的:进行紫杉醇药物生物合成前五步催化酶二磷酸盐合酶(GGPPS)、紫杉二烯合酶(TS)、紫杉二烯5α羟化酶(THY5α)、紫杉二烯5α-O-乙酰转移酶(TAT)和紫杉烷10β羟化酶(TDH)基因在大肠杆菌异源生物合成途径的组建及串联,实现单个表达及串联表达,并试图通过连续生物催化获得紫杉醇中间体紫衫二烯。方法:依据合成生物学中Brick基因组装方法,通过对载体pET30a的酶切位点进行定向改造,设计独特的BglⅡ/BamHⅠ和XbaⅠ/SpeⅠ串联表达盒,在大肠杆菌BM Rosetta(DE3)中表达产物。结果:设计多基因表达盒,实现紫杉醇药物生物合成前五步催化酶的单个表达,GGPPS和TS以及THY5α、TAT和TDH的串联表达。结论:利用BglBrick/BioBrick基因组装方法,可以实现紫杉醇生物合成催化酶的快速组装及后续表达。     

利用BglBrick方法进行HSA/Exendin-4长效融合蛋白的快速组装

目的：通过合成生物学的BglBrick方法快速构建不同种类HSA/ Exendin-4长效融合蛋白,为进行各HSA/Exendin-4融合蛋白生物学活性的筛选比较奠定基础。方法：选用酵母表达载体pPICZαA质粒,构建pPICZαA-E4和pPICZαA-HSA两种基础Brick表达载体,运用BglBrick方法,实现了不同数目Exendin-4分子在HSA的不同末端的快速组装。将构建出的10种HSA/Exendin-4融合蛋白,转入毕赤酵母菌KM71H中,用甲醇诱导目的蛋白的表达。结果：用BglBrick方法构建的HSA/Exendin-4融合蛋白在毕赤酵母中都成功诱导表达出相应的目的蛋白。结论：利用BglBrick方法能够实现HSA长效融合蛋白的快速组装。     

人Notch受体胞内区基因N2ICD和N3ICD克隆及真核表达体系的构建

Notch信号通路与多种肿瘤的发生发展密切相关。对该通路中各受体功能的深入研究能够为揭示其致癌作用奠定基础。本研究采用RT-PCR的方法从人宫颈癌细胞系HeLa细胞的cDNA中克隆人Notch2和Notch3受体胞内区基因(N2ICD和N3ICD基因),并构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的真核表达载体N2ICD/pEGFP和N3ICD/pEGFP,将序列正确的重组质粒转染HeLa细胞,显微镜下可见明显的绿色荧光,并定位在细胞核内。Western blotting检测目的蛋白成功融合表达,并能够提高其下游靶基因Hes1的转录活性。     

蕙兰CfCIN基因克隆及其功能分析

以蕙兰(Cymbidium faberi Rolfe)为试验材料,采用RT-PCR技术克隆了TCP家族的CIN同源基因,开放阅读框长1 161bp,编码386个氨基酸,将其命名为CfCIN(GenBank登录号为KJ956809)。为进一步分析CfCIN的功能,构建了植物表达载体,采用农杆菌介导法转化非洲紫罗兰叶片,获得了转化植株并对转基因植株进行了性状分析。结果显示:与野生型非洲紫罗兰叶片相比,转基因植株的叶片更大,由圆形变为卵圆形,叶缘由平整光滑变为有缺刻且稍向后卷曲,叶脉明显,叶柄红,花器官形状变化不明显。研究表明,CfCIN可能参与调控植物叶片的形态建成。     

病毒入胞机制研究方法及其研究进展

多数病毒家族利用胞吞作为入侵宿主细胞的途径。胞吞既可以介导病毒内化,也可以将病毒运输到复制位点。已知的胞吞途径包括:网格蛋白依赖型内吞、小窝蛋白依赖型内吞、巨胞饮和网格蛋白、小窝蛋白非依赖型内吞。随着对胞吞过程中各组分结构和功能了解的日趋深入,研究胞吞过程以及病毒入侵过程的手段也变得更有效,特异性更高。目前,化学抑制剂的使用仍十分普遍,但该方法常非特异性地阻断细胞某些功能。一些分子抑制方法,如过表达显性负突变体和siRNA技术等,因其对单一途径的特异性阻断,使得应用分子型抑制剂逐渐取代了化学抑制剂。本文主要分析了研究病毒入侵途径时所使用的实验方法,并列举了一些实例。