利用VNTR分子标记鉴定蜜蜂群内蜂王交配次数和雄蜂母系来源

如何准确测定蜂王交配次数和雄蜂母系来源,是研究蜜蜂亚家系行为生物学的关键。本研究利用王浆主蛋白（MRJPs）的串联重复序列多态性（VNTR）分子标记分别鉴定了蜂王单雄人工授精、双雄人工授精和自然交尾的中华蜜蜂Apis cerana cerana蜂群中的蜂王交配次数和雄蜂母系来源。结果表明： 在蜂王单雄人工授精和双雄人工授精蜂群中,蜂王的交配次数分别为1和2;在蜂王自然交尾的2个蜂群中,蜂王的交配次数分别为8和5。另外,经鉴定发现：在以上实验蜂群中,所有雄蜂都是由蜂王产的未受精卵发育而来。因此,作为一种分子标记,蜜蜂MRJPs VNTR能简单、有效地鉴定蜂群内蜂王的交配次数和雄蜂母系来源。     

中华蜜蜂雄蜂脑部组织结构观察

通过组织化学方法,对中华蜜蜂Apis cerana cerana Fabricius雄蜂的脑部的形态结构进行观察。结果表明,雄蜂的脑由前脑、中脑和后脑三部分构成,前脑视叶两侧具有大而显著的复眼,而其他结构相对较小。蕈形体在脑中所占的比例小于工蜂和蜂王;中心体的比例小于工蜂,与蜂王接近;中脑的嗅叶相对较为发达,这使它们在同蜂王的交配过程中,能够更灵敏地接收来自于蜂王性外激素的刺激。中华蜜蜂雄蜂的嗅叶具有性二态现象,但是与意大利蜜蜂Apis mellifera L.雄蜂发达的巨大纤维球复合体相比,中华蜜蜂并不明显;除此之外,它们在脑部结构上没有显著差异。     

婚飞行为影响中华蜜蜂性成熟处女蜂王的基因表达

婚飞是性成熟处女蜂王与雄蜂交配过程中的一个重要前奏, 在该过程中蜂王体内伴随着一系列重要的生理变化。为了探究中华蜜蜂Apis cerana cerana处女蜂王婚飞过程中基因表达变化, 本研究利用数字基因表达谱(digital gene expression, DGE) 技术分析了中华蜜蜂性成熟处女蜂王飞行与未飞行之间的基因表达差异。经DGE测序, 分别从两个样品中获得5.98和6.01 百万条Clean标签。通过分析检测到250个基因有差异表达, 其中133个基因在飞行蜂王中上调表达, 117个基因在飞行蜂王中下调表达。这些差异基因可以归类到348个功能性类别和142个生化途径。结果表明中华蜜蜂性成熟处女蜂王在婚飞过程中大量基因的表达发生了变化。这些结果为进一步研究中华蜜蜂蜂王婚飞过程中生理变化的分子机制提供了重要的基因表达信息。     

羽化和性成熟时中华蜜蜂蜂王和雄蜂转录组分析

【目的】为了系统了解中华蜜蜂Apis cerana cerana蜂王和雄蜂转录组特征,丰富蜜蜂转录组数据信息。【方法】本研究利用高通量测序的方法分别检测中华蜜蜂蜂王和雄蜂刚出房、性成熟时期以及性成熟期蜂王生殖系统和雄蜂生殖系统之间转录组表达差异。【结果】经过测序获得质量值不低于20的碱基比例（Q20）均高于90%;所有reads组装成90 839个unigenes,平均长度1 549 bp;基于5个数据库(NR,Swiss Prot,GO,COG和KEGG)进行比对,共有45 112个unigenes被注释。差异基因表达分析发现,与刚出房时相比,性成熟的蜂王和雄蜂均在表皮蛋白、细胞色素P450、气味结合蛋白等家族基因上存在显著差异表达,而且这些差异表达基因与蜜蜂生长发育和性成熟过程中蜜蜂骨骼发育、生殖系统发育、嗅觉发育等方面有关;性成熟蜂王与性成熟雄蜂之间以及它们生殖系统之间在气味结合蛋白基因方面存在显著差异。【结论】结果表明,中华蜜蜂在性成熟过程中,体内大量基因的表达发生了变化。这些结果揭示了中华蜜蜂性成熟发育的整体基因表达特征,在得到大量转录组unigene序列的同时,获得了一批与蜜蜂性成熟有关的基因序列,为深入开展中华蜜蜂生长发育与繁殖研究提供了丰富的数据资源。     

中华蜜蜂与意大利蜜蜂蜂王体表信息素含量比较

【目的】分析中华蜜蜂Apis cerana cerana与意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica蜂王不同时期的体表信息素含量变化,探索两蜂种之间蜂王交尾干扰机理。【方法】本试验通过GC-MS检测并分析了中华蜜蜂蜂王和意大利蜜蜂蜂王刚出房、性成熟时期以及婚飞过程中体表信息素含量变化。【结果】研究结果表明:中华蜜蜂性成熟蜂王在飞行过程中,其体表9-ODA含量显著高于刚出房蜂王,9-HDA显著高于刚出房蜂王和性成熟蜂王;意大利蜜蜂飞行蜂王在9-ODA含量也显著高于刚出房蜂王。另外,意大利蜜蜂性成熟期蜂王在9-ODA、9-HDA、10-HDA含量显著高于中华蜜蜂蜂王,而两蜂种蜂王体表信息素在婚飞时期差异不显著。【结论】同种蜂王不同发育时期,其体表信息素含量存在差异;中华蜜蜂蜂王与意大利蜂王在婚飞过程中,其体表信息素差异不显著,但部分体表信息素在性成熟而未进行婚飞时差异显著。     

CO2麻醉对中华蜜蜂处女蜂王卵巢发育的影响

【目的】明确中华蜜蜂Apis cerana cerana蜂王羽化后生殖系统的动态变化,探索CO₂麻醉对中华蜜蜂处女蜂王卵巢发育的影响。【方法】通过人工育王技术和蜂王的储存获取不同日龄的中华蜜蜂处女蜂王,观察蜂王羽化后生殖系统的形态,测定生殖系统各项形态学指标(体重、卵巢重、受精囊直径和卵巢管数目)。中华蜜蜂处女蜂王连续2 d(分别于5和6日龄时)接受不同浓度(50%, 75%与90%)CO₂麻醉8 min, 以及不同日龄处女蜂王接受75% CO₂麻醉1~3次(每次8 min),待蜂王发育至10日龄时,利用石蜡切片技术与HE染色法观察蜂王卵巢形态、测定蜂王卵巢重和蜂王卵巢最大卵母细胞长度,通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)测定10日龄蜂王头部卵黄原蛋白基因(Vg)的相对表达量。【结果】中华蜜蜂蜂王的卵巢管数目与受精囊直径不会随着日龄发生明显的波动,但蜂王卵巢重在6-12日龄明显增加,之后将趋于稳定。与对照组(未接受CO₂麻醉处理)相比,50%, 75%与90% CO₂麻醉后中华蜜蜂蜂王卵巢重与最大卵母细胞长度均增加,并且头部Vg基因的相对表达量上调。其中CO₂浓度为75%,麻醉次数2次显著促进了中华蜜蜂蜂王的卵巢发育。【结论】中华蜜蜂蜂王羽化后卵巢会发生明显的发育变化,而CO2麻醉能加速卵巢的发育。     

授粉用明亮熊蜂的人工饲养技术

为提高授粉用熊蜂人工繁育效率,降低生产成本,对明亮熊蜂Bombus lucorumL.人工饲养中诱导蜂王产卵和人工控制下的交配2个技术环节进行了研究。结果表明,采用诱导器和伴饲2~3只蜜蜂工蜂的诱导方法,蜂王产卵率和蜂群成群率最高,成群时间最短;使用塑料诱导器和木制诱导器的效果没有显著差异。将8~9日龄的蜂王和11~12日龄的雄蜂放入交配笼时,其交配成功率最高。交配笼内的蜂王数量应控制在30只/m3左右。在晴天,交配笼放置在室外(758 000 lux),其交配成功率最高;在阴天,交配笼应放在交配室内,并开启荧光灯照明(35 000 lux),其交配成功率最高。     

中华蜜蜂DNA甲基化转移酶Dnmt3基因克隆及表达谱分析

为探究中华蜜蜂Apis cerana cerana的DNA甲基化模式, 本研究采用RT PCR技术克隆了中华蜜蜂DNA甲基化转移酶3（Dnmt3）基因(GenBank登录号为JQ740768); 采用荧光定量PCR检测不同发育时期工蜂（4日龄蛹, 1, 7和30日龄成年蜂及产卵工蜂）和蜂王（4日龄蛹, 1日龄蜂王和产卵蜂王）头部的Dnmt3基因mRNA的表达量。结果表明： 该基因cDNA序列全长2 277 bp, 编码758个氨基酸残基, 预测的蛋白分子量为88.24 kD, 等电点为7.85。将中华蜜蜂与其他物种的Dnmt3基因的结构域进行比对, 同时将该基因推导的氨基酸序列与其他物种的Dnmt3氨基酸序列进行同源性比对和系统发育分析, 发现与西方蜜蜂的Dnmt3序列一致性高达99%。该基因在工蜂和蜂王不同发育时期均有表达, 1日龄工蜂与7日龄工蜂中没有显著差异(P>0.05), 30日龄工蜂中的表达量显著高于前两者 (P<0.05); 蜂王蛹中的表达量显著高于工蜂蛹 (P<0.05); 1日龄的蜂王中的表达量显著高于1日龄的工蜂(P<0.05); 产卵工蜂与产卵蜂王中的表达量没有差异（P>0.05）。这种表达情况提示其可能与工蜂劳动分工及蜜蜂卵巢发育有关。     

中华蜜蜂气味结合蛋白AcerOBP14的表达及配体结合特性分析

【目的】气味结合蛋白(odorant binding proteins, OBPs)在昆虫寄主定位、产卵地选择等行为中发挥着重要作用,明确中华蜜蜂Apis cerana cerana AcerOBP14与配体的结合特性有助于阐明中华蜜蜂嗅觉识别的分子机制。【方法】通过qRT-PCR测定OBP14在20日龄中华蜜蜂成年工蜂、20日龄中华蜜蜂成年雄蜂、中华蜜蜂采粉蜂和意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica采粉蜂触角中的表达量。构建原核表达载体pET28a/AcerOBP14,表达并分离纯化重组蛋白AcerOBP14。利用荧光竞争结合实验检测AcerOBP14与37 种气味配体化合物的结合特性。【结果】qRT-PCR分析发现, OBP14在中华蜜蜂采粉蜂触角中的表达量极显著高于20日龄中华蜜蜂成年工蜂和雄蜂以及意大利蜜蜂采粉蜂中的。荧光竞争结合实验表明,AcerOBP14与蜂王信息素、告警信息素、那氏信息素及多种植物挥发物都具有结合能力,其中与β 罗勒烯的结合能力最强,解离常数 Ki=0.297 μmol/L。【结论】AcerOBP14的配体结合谱较宽,暗示其可能参与了中华蜜蜂的多种生理行为反应,且在中华蜜蜂的采粉行为中发挥着重要作用。     

蜂王上颚腺信息素对中华蜜蜂、意大利蜜蜂雄蜂选择行为的影响

【目的】分析蜂王上颚腺信息素(Queen mandibular pheromone,QMP)对中华蜜蜂Apis cerana cerana(简称中蜂)雄蜂与意大利蜜蜂Apismelliferaligustica(简称意蜂)雄蜂行为反应的变化,探索两蜂种雄蜂之间婚飞的干扰机理。【方法】本试验通过室内Y型嗅觉仪检测QMP及其主要成分反式-9-氧代-2-癸烯酸[(E)-9-oxodec-2-enoicacid,9-ODA]对飞行、爬行状态下中蜂雄蜂与意蜂雄蜂选择行为的差异进行研究。【结果】飞行或爬行状态下的中蜂雄蜂和意蜂雄蜂,均对3.5、7.0和14.0μg/μL的9-ODA没有显著趋向性反应(P 0.05);飞行中蜂雄蜂、飞行与爬行意蜂雄蜂均对0.04、0.2、1.0及7.0μg/μL的QMP具有显著趋避反应(P 0.05),而QMP对爬行中蜂雄蜂无显著影响(P 0.05);在中蜂雄蜂和意蜂雄蜂共存时的试验中发现:飞行、爬行意蜂雄蜂均对7.0μg/μL QMP存在显著趋避反应(P 0.05),而7.0μg/μL QMP对飞行或爬行中蜂雄蜂均无显著影响(P 0.05)。【结论】在室内环境下,QMP对中蜂、意蜂雄蜂有驱避作用。     

中华蜜蜂精子介导egfp基因转移

中华蜜蜂Apis cerana cerana是一种真社会性昆虫,也是我国重要的经济昆虫。本实验目的是为了检测精子是否可以作为载体将外源egfp基因介导转入中华蜜蜂。首先将雄蜂精子与线性化的质粒DNA共浴,然后通过人工授精技术将精子导入处女王,再对实验蜂群后代进行分析。结果显示EGFP蛋白在一群实验组蜂的1～2日龄小幼虫中表达较强,能检测到0.01%～0.02%荧光阳性小幼虫个体;通过PCR和RT-PCR技术分析,证实转入的外源egfp基因获得表达。实验结果表明精子载体法能够用于中华蜜蜂外源基因的转移和表达。     

雌性中华蜜蜂胚胎发育组织形态观察

【目的】探索雌性中华蜜蜂Apis cerana cerana胚胎组织发育过程。【方法】在正常蜂群中,用蜂王产卵控制器将蜂王限制在工蜂巢房的巢脾上产卵1 h,蜂王在工蜂巢房中产下的卵是受精的雌性卵,将有卵的巢脾割下放入恒温恒湿箱中培养。恒温恒湿箱中样本所在的位置温度严格控制在35±0.2℃,相对湿度75%±5%。把限王产卵1 h内获得的蜜蜂卵作为0 h胚胎,每隔4 h取样一次。采用石蜡切片技术,对二倍体雌性中华蜜蜂胚胎发育过程进行观察。【结果】根据胚胎发育过程中的形态特征,雌性中华蜜蜂胚胎发育过程划分为4个阶段:(1)卵裂期(0-12 h),活质体迁移到卵的表面,呈双层排列;(2)胚盘形成期(12-28 h),活质体排列为单层,并形成细胞膜;(3)胚层形成期(28-40 h),侧板覆盖中板,两者在腹中线愈合;(4)胚胎器官系统形成期(40-68 h)。【结论】本研究明确了雌性中华蜜蜂胚胎发育过程的形态变化,进行了阶段划分并明确了各发育阶段的形态特征及对应的发育时间。本项研究结果有助于开展与蜜蜂胚胎发育的相关蜜蜂生态学、发育生物学、营养学等课题深入研究。     

中华蜜蜂dynactin p62基因的克隆及不同发育阶段表达分析

为探究中华蜜蜂Apis cerana cerana dynactin p62基因的表达特性, 本研究克隆了中华蜜蜂dynactin p62的基因组DNA序列(GenBank登录号： JX101463) 和mRNA序列（GenBank登录号： JX101464）; 采用荧光定量PCR检测了中华蜜蜂dynactin p62在不同发育时期（3日龄和6日龄幼虫、 刚羽化出房蜜蜂）三型蜂中mRNA的表达量。结果表明： 该基因基因组DNA序列全长为2 403 bp, mRNA序列全长为1 491 bp, 编码496个氨基酸残基, 预测的蛋白分子量为56.49 kD, 等电点为8.31。系统发育分析表明中华蜜蜂dynactin p62与西方蜜蜂Apis mellifera dynactin p62聚成一支。该基因在不同发育时期均有表达, 在雌性蜜蜂（蜂王和工蜂）中, 刚羽化成虫期的表达量显著高于幼虫期(P<0.05), 并且同一发育时期相比, 工蜂的表达量显著高于蜂王(P<0.05); 而该基因在雄蜂中表达量没有明显的规律性。这些结果提示该基因可能与中华蜜蜂级型分化有关。     

幼虫信息素中三种酯类对中华蜜蜂和意大利蜜蜂工蜂哺育和封盖行为以及蜂王发育影响

为研究蜜蜂幼虫信息素中3种酯类成分（甲基棕榈酸酯、乙基棕榈酸酯和乙基油酸酯）对中华蜜蜂Apis cerana cerana和意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂哺育行为、封盖行为以及蜂王发育影响, 在人造蜂蜡王台中加入1%和0.1%（w/w）的3种酯类作为实验组, 以不添加酯类（0%）的为对照组, 移入1日龄工蜂幼虫, 测定王台接受率、单个王台中幼虫和王浆重量; 另将分别添加1%和0.1%（w/w）3种酯类的石蜡假幼虫放入工蜂巢房中, 同样设对照组, 测定假幼虫的封盖率; 在新鲜王浆中以1%和0.1%（w/w）分别加入3种酯类作为实验组, 以不添加酯类（0%）的作为对照组, 再分别在1日龄、2日龄和3日龄幼虫王台中加入0.01 mL含有酯类的蜂王浆, 并测定蜂王初生重和卵巢管数量。结果表明: 0.1%甲基棕榈酸酯可以显著提高中蜂和意蜂幼虫重量; 意蜂的甲基棕榈酸酯和乙基油酸酯两个实验组(1.0%, 0.1%)假幼虫封盖率都极显著高于对照组; 乙基油酸酯两个实验组(1.0%, 0.1%)都显著降低了中蜂和意蜂蜂王初生重和卵巢管数量。这说明不同蜜蜂幼虫信息素具有不同的生物学效应。     

中蜂与意蜂无王群培育非自身蜂种蜂子及改造王台特性

以中华蜜蜂和意大利蜜蜂为试验材料,通过组织相应无王群,把一蜂种无王群中的子脾加入到另一蜂种无王群中,进行中蜂和意蜂无王群培育非自身蜂种蜂子和改造王台特性研究,当未培育出蜂王时,分别从原有王群中调入子脾进行第2、第3期试验。结果表明:中蜂无王群中的工蜂会清除引入意蜂子脾中的蜂卵,但随着引入意蜂子脾封盖子羽化出房的意蜂幼蜂数量增加而逐渐接受意蜂幼虫,蜂群未改造意蜂王台,只培育出中蜂蜂王;意蜂无王群中的工蜂会随着引入中蜂子脾中羽化出房的中蜂幼蜂数量增加而逐渐接受中蜂卵及幼虫,并从第2期试验开始会改造中蜂王台,但最终只培育出意蜂蜂王。     

意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)与中华蜜蜂(Apis cerana ceraca)的生态位比较

为了明确中华蜜蜂和意大利蜜蜂在皖南山区生态适应性,研究两种蜜蜂的食物生态位、时间生态位和空间生态位及其差异,结果是中蜂与意蜂食物(蜜源植物)资源生态位宽度分别是 0.923、0.765,中蜂对蜜源植物采集喜好性差异小,而意蜂差异大,中蜂对意蜂生态位重迭为0.160,中蜂对意蜂生态位相似性为0.755;油菜花期,中蜂与意蜂时间资源生态位宽度分别是0.879、0.801,枇杷花期,分别是0.760、0.677,中蜂与意蜂的空间资源生态位宽度分别是0.797、0.670.中蜂3种生态位宽度均大于意蜂,中蜂三维生态位值是意蜂的1.61倍和1.57倍.表明中蜂在皖南山区生态适应性比意蜂强.