棉铃虫幼虫中肠主要蛋白酶活性的鉴定

根据棉铃虫Helicoverpa armigera(Hubner)中肠酶液对蛋白酶专性底物在不同pH下的水解作用,棉铃虫中肠的3种丝氨酸蛋白酶得到鉴定。它们是：强碱性类胰蛋白酶,水 解a-N-苯甲酰-DL-精氨酸-p-硝基苯胺的最适pH在10.50以上;弱碱性类胰蛋白酶,水解p-甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯的最适pH为8.50～9.00;类胰凝乳蛋白酶, 水解N一苯甲酰-L-酪氨酸乙酯的最适pH亦为8.50-9.00。中肠总蛋白酶活性用偶 氮酪蛋白测定,最适pH亦在10.50以上。Ca²⁺对昆虫蛋白酶无影响,Mg²⁺仅对弱碱性类胰蛋白酶有激活作用。对苯甲基磺酰氟和甲基磺酰-L-赖氨酸氯甲基酮对弱碱性类胰蛋白酶的抑制作用较强,而对强碱性类胰蛋白酶的抑制作用较弱。甲基磺酰-L苯丙氨酸氯甲基酮除能抑制类胰凝乳蛋白酶外,还能激活弱碱性类胰蛋白酶。对牛胰蛋白酶有强抑制作用的卵粘蛋白抑制剂对昆虫蛋白酶却无抑制作用。大豆胰蛋白酶抑制剂对该虫的3种丝氨酸蛋白酶均有强的抑制作用。     

蛋白酶抑制剂对绿豆象幼虫中肠蛋白酶活性的影响

为明确蛋白酶抑制剂对绿豆象幼虫中肠蛋白酶活性的影响,采用室内人工接虫和生化测定的方法,研究了在离体条件和饲喂条件下4种蛋白酶抑制剂对绿豆象幼虫中肠蛋白酶的抑制作用,并测定了绿豆象幼虫取食不同含量的绿豆胰蛋白酶抑制剂(MBTI)的人工绿豆后,其中肠内总蛋白酶、类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶活性的变化.结果表明:在离体条件下,供试4种蛋白酶抑制剂对绿豆象幼虫总蛋白酶、类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶活性均有明显的抑制作用,且浓度越大,抑制效果越显著,其中以20μg·mL^-1的MBTI对3种酶活性的抑制效果最强,3种酶活性分别比对照降低了62.5%、41.2%和38.7%,而卵粘蛋白抑制剂(OI)抑制效果最弱.绿豆象幼虫取食含不同抑制剂的人工绿豆后,中肠内3种酶活性也均受到一定的抑制作用,取食后随龄期的延长,3种酶活性有所升高但仍显著低于对照,且以MBTI的抑制作用最强.当绿豆象幼虫取食不同含量MBTI的人工绿豆后,随MBTI含量的增加,对总蛋白酶活性和类胰蛋白酶活性的抑制作用均逐渐增强,但对类胰凝乳蛋白酶活性的抑制作用并不显著,只有当MBTI含量达20%时,对类胰凝乳蛋白酶活性才表现出明显的抑制作用.     

五种寄主植物对甜菜夜蛾幼虫中肠蛋白酶活性的影响

甜菜夜蛾Spodoptera exigua(Hübner)是重要的多食性、暴食性农业害虫之一。其寄主广泛,可危害禾谷类、甜菜、蔬菜、棉花等作物及杂草。昆虫中肠胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶在昆虫消化和生长发育中起重要的作用。本研究分别用辣椒、豇豆、玉米、甘蓝、反枝苋5种寄主植物饲喂甜菜夜蛾幼虫,利用酶专性底物分别测定了甜菜夜蛾幼虫中肠总蛋白酶活性、强碱性胰蛋白酶活性、弱碱性胰蛋白酶活性和胰凝乳蛋白酶活性。结果表明:甜菜夜蛾中肠总蛋白酶活性、强碱性胰蛋白酶活性、弱碱性胰蛋白酶活性以及胰凝乳蛋白酶活性在不同寄主植物之间存在显著差异,取食反枝苋甜菜夜蛾各中肠蛋白酶活性均高,取食甘蓝的各中肠蛋白酶活性均低,而取食玉米、豇豆、辣椒居中且活性差异不显著。取食同一寄主植物(反枝苋或甘蓝)不同龄期甜菜夜蛾幼虫的中肠蛋白酶活性也各不相同,随着龄期的增加,各中肠蛋白酶活性总体呈下降趋势,2龄幼虫的酶活性偏高,而5龄的酶活性显著低于其他龄期的酶活性。本研究明确了不同寄主植物对甜菜夜蛾幼虫中肠蛋白酶活性的影响,结果对明确甜菜夜蛾对寄主的适应性及对以中肠蛋白酶为靶标的害虫防治具有一定参考价值。     

Cry1Ac杀虫蛋白对粘虫中肠几种酶活性的影响

为阐明Bt杀虫蛋白对次要靶标害虫粘虫Mythimna separata (Walker) （鳞翅目： 夜蛾科）的生理学影响, 本研究分析比较了粘虫高龄幼虫在室内取食低剂量Cry1Ac杀虫蛋白6, 12, 24和36 h后, 其体内主要的解毒酶（酯酶和谷胱甘肽-S-转移酶）、 保护酶（超氧化物歧化酶、 过氧化氢酶和过氧化物酶）和中肠蛋白酶（总蛋白酶、 强碱性类胰蛋白酶、 弱碱性类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶）等活性的变化。结果表明, 取食Cry1Ac杀虫蛋白后, 粘虫幼虫体内相关酶活力呈现不同的变化趋势： （1）酯酶、 谷胱甘肽-S-转移酶、 过氧化物酶(POD)、 类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶活力较对照显著降低（P<0.05）; （2）超氧化物歧化酶(SOD) 活力较对照显著升高（P<0.05）; （3）过氧化氢酶(CAT) 活力于6, 12和24 h显著低于对照（P<0.05）, 36 h时显著高于对照（P<0.05）。结果提示Cry1Ac杀虫蛋白主要通过抑制粘虫幼虫中肠解毒酶和蛋白酶的活性, 扰乱SOD, CAT 和POD 3种保护酶的动态平衡而干扰幼虫的正常生理代谢, 从而起到毒杀粘虫的作用。     

蛋白酶抑制剂对梨小食心虫幼虫中肠蛋白酶活性的影响

【目的】梨小食心虫Grapholitha molesta(Busck)是一种危害极其严重的果树害虫。中肠蛋白酶在昆虫生长发育过程中起着重要作用。本研究测定梨小食心虫幼虫中肠内蛋白酶活性的最适p H、蛋白酶抑制剂和激活剂对蛋白酶活性的作用,为利用蛋白酶抑制剂防治该害虫提供新思路。【方法】提取梨小食心虫3龄幼虫中肠液,利用酶专性底物测定各蛋白酶在3种不同缓冲溶液中的最适p H(dd H2O为对照)、蛋白酶抑制剂和激活剂对中肠蛋白酶活性的影响,同时测定饲喂蛋白酶抑制剂(PMSF,TLCK,TPCL和STI)后梨小食心虫中肠蛋白酶活性的变化。【结果】梨小食心虫幼虫中肠总蛋白酶在Tris-HCl,KH2PO4/Na OH和Glycine/Na OH 3种缓冲液中最适p H分别为10.5,11.0和11.0,强碱性胰蛋白酶的最适p H分别为10.5,11.0和11.0,弱碱性胰蛋白酶的最适p H分别为8.5,9.0和9.0,胰凝乳蛋白酶的最适p H分别为8.5,9.0和9.5。5种蛋白酶抑制剂(DTT,PMSF,TLCK,TPCL和STI)中,除TLCK对凝乳蛋白酶激活外,其他蛋白酶抑制剂对4种蛋白酶均表现为抑制,且浓度越大抑制效应越明显。抑制剂DTT对总蛋白酶和弱碱性胰蛋白酶的抑制效果高于其他抑制剂。4种蛋白酶激活剂(Mg Cl2,Ca Cl2,EDTA和EGTA)中,Mg Cl2抑制总蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性,而激活胰蛋白酶活性;Ca Cl2激活总蛋白酶和弱碱性胰蛋白酶活性,而抑制强碱性胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶,EDTA对4种蛋白酶均表现为抑制,EGTA除对强碱性胰蛋白酶表现为激活外,对另外3种蛋白酶表现抑制。用蛋白酶抑制剂PMSF,TLCK,TPCL和STI饲喂梨小食心虫幼虫,各抑制剂均可抑制4种蛋白酶活性,且在不同取样时间抑制水平不同。其中STI(50μg/m L)对4种蛋白酶的抑制效果高于其他抑制剂,且浓度越大抑制效应越明显。10,20和50μg/m L STI 3种浓度处理组,在取食后4 h时,4种蛋白酶活性升高,且上升程度与STI浓度有关;酶活性在20μg/m L STI处理后48 h,50μg/m L STI处理后60 h时最低,抑制剂STI表现出持效性。【结论】蛋白酶抑制剂对梨小食心虫幼虫中肠蛋白消化酶的活性具有一定的抑制作用,其中大豆胰蛋白酶抑制剂STI在害虫防治中具有极其重要的应用价值。     

CO_2浓度升高对粘虫幼虫体内酶活性的影响

【目的】阐明大气CO_2浓度升高对粘虫Mythimna separata(Walker)幼虫不同龄期体内酶活性的影响机制。【方法】测定分析了人工气候箱内不同CO_2浓度(800mL/L和400mL/L)条件下,粘虫幼虫体内4种解毒酶[羧酸酯酶(Car E)、乙酰胆碱酯酶(Ach E)、微粒体多功能氧化酶(MFO)和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)]、3种保护酶[超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)]和4种蛋白酶(总蛋白酶、强碱性类胰蛋白酶、弱碱性类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶)活性的变化。【结果】(1)粘虫不同龄期幼虫体内4种解毒酶的活力均随着CO_2浓度升高而显著上升(P<0.05);(2)粘虫幼虫体内的保护酶中SOD酶活性在CO_2浓度为800mL/L条件下低于对照(CO_2浓度为400mL/L)条件下的酶活性,其中4至6龄幼虫的下降趋势较为显著(P<0.05),而POD、CAT酶活性均呈上升趋势,800mL/L浓度下的CAT活力均显著高于对照(P<0.05);(3)高CO_2浓度条件下粘虫总蛋白酶的酶活性随着龄期的增加呈现先上升后下降的趋势,强碱/弱碱性类胰蛋白和类胰凝乳蛋白3种酶的比活力均低于400mL/L CO_2浓度下的比活力,其中类胰凝乳蛋白酶比活力显著低于对照条件下的比活力(P<0.05)。【结论】在高CO_2浓度条件下,粘虫幼虫体内的大多数酶系活力呈现下降趋势,大部分解毒酶和蛋白酶活性受到抑制,SOD、CAT和POD 3种保护酶的动态平衡受到干扰而影响其正常的生理代谢,机体受损伤并随龄期的增加而加重。     

大豆胰蛋白酶抑制剂与棉酚或丹宁混用对棉铃虫中肠蛋白酶和生长率的影响

本文报告了大豆胰蛋白酶抑制剂(STl)与棉酚、丹宁酸单一和协同作用对棉铃虫Helicoverpa armigera(Hubner)幼虫中肠蛋白酶活性和生长速率的影响。在离体条件下,STI、棉酚和丹宁酸均对中肠蛋白酶有抑制作用,以STI的作用最强。活体试验表明,人工饲料中0.84%(干重)的S丁I对强碱性类胰蛋白酶活力有显著抑制作用;0.3%丹宁酸则对弱碱性类胰蛋白酶和总蛋白酶活力有显著抑制作用;0.3%棉酚对几种蛋白酶活力的影响均不显著。三者均能显著抑制幼虫的生长,而Sn与棉酚或丹宁酸的协同作用比三者的单独作用更能有效地抑制幼虫的生长发育和中肠蛋白酶活性。     

大豆胰蛋白酶抑制剂与棉酚或丹宁混用对棉铃虫中肠蛋白酶和生长率的影响

本文报告了大豆胰蛋白酶抑制剂(STl)与棉酚、丹宁酸单一和协同作用对棉铃虫Helicoverpa armigera(Hubner)幼虫中肠蛋白酶活性和生长速率的影响。在离体条件下,STI、棉酚和丹宁酸均对中肠蛋白酶有抑制作用,以STI的作用最强。活体试验表明,人工饲料中0.84%(干重)的S丁I对强碱性类胰蛋白酶活力有显著抑制作用;0.3%丹宁酸则对弱碱性类胰蛋白酶和总蛋白酶活力有显著抑制作用;0.3%棉酚对几种蛋白酶活力的影响均不显著。三者均能显著抑制幼虫的生长,而Sn与棉酚或丹宁酸的协同作用比三者的单独作用更能有效地抑制幼虫的生长发育和中肠蛋白酶活性。     

转Bt基因抗虫玉米对亚洲玉米螟幼虫几种主要酶系活性的影响

研究了表达Cry1Ab杀虫蛋白的转Bt基因抗虫玉米对亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis (uenée) 幼虫解毒酶、保护酶和中肠蛋白酶活性的影响,测定比较了取食转Bt基因玉米后幼虫体内α-乙酸萘酯酶、乙酰胆碱酯酶、谷胱甘肽S-转移酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、中肠总蛋白酶、类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶的活力。结果表明,取食转Bt基因玉米48 h后亚洲玉米螟幼虫体内的α-乙酸萘酯酶、谷胱甘肽S转移酶活力明显低于对照;而乙酰胆碱酯酶活力显著高于对照,在取食48 h、60 h和72 h的活力分别是对照的2.00、1.50和2.50倍。保护酶系、中肠总蛋白酶、弱碱性类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶的活性在取食48 h后明显受到抑制;但强碱性类胰蛋白酶的活性显著高于对照,取食48 h、60 h和72 h的活力分别是对照的4.00、1.67和1.33倍。乙酰胆碱酯酶和强碱性类胰蛋白酶可能与亚洲玉米螟对Bt的抗性有关。     

三种鳞翅目幼虫肠道蛋白水解酶的活性

本工作以酪蛋白为底物,测定粘虫Mythimna separata Walker、棉铃虫Heliothis armigera Hubner和大蜡螟 Galleria mellonlla Linnaeus三种鳞翅目幼虫肠道蛋白水解酶的活性,并分别用BTEE和TAME为底物,测定了其中类胰凝乳蛋白酶和类胰蛋白酶的活性.结果表明:三种幼虫肠道都含有类胰凝乳蛋白酶和类胰蛋白酶.抑制剂TPCK可以部分地抑制类胰凝乳蛋白酶的活性,而胰酶抑制剂则显著地抑制类胰蛋白酶的活性.     

Cry2Ab及Cry1Ac杀虫蛋白对棉铃虫中肠蛋白酶活性的影响

为明确Cry2Ab和Cry1Ac2种Bt杀虫蛋白单用与混用对棉铃虫Helicoverpa armigera（Htibner）中肠主要蛋白酶活性的影响,本文测定了取食含不同Bt蛋白人工饲料后棉铃虫中肠总蛋白酶、类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶活性的差异。结果发现：Cry2Ab处理12h后对棉铃虫中肠总蛋白酶影响不大;对类胰蛋白酶的影响最大,除最高浓度处理外,其他浓度处理后棉铃虫类胰蛋白酶的活性明显高于对照;但对类胰凝乳蛋白酶活性的影响呈倒“V”字型,只有6．67ug／gCry2Ab处理后的棉铃虫酶活力显著高于对照,其他浓度处理与对照差异不显著或略低于对照;随着取食含Cry2Ab饲料时间的增加,棉铃虫中肠类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶的活性比对照显著增加;与对照相比,处理36h后类胰蛋白酶活性最高可增加到6．43倍。Cry1Ac处理棉铃虫12h后总蛋白酶、类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶活性都明显增加,而且与处理浓度呈正相关;但是24h后,处理后棉铃虫的总蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶活性明显降低,只有类胰蛋白酶活性仍高于对照,但活性增长倍数低于12h时的处理。Cru2Ab和Cry1Ac2种蛋白混用处理棉铃虫后,2种酶的酶活力基本低于Cry1Ac和Cry2Ab单用的酶活力之和;只有2种蛋白浓度均为2．22ug／g混用时,处理12h后类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶的活性高于2种蛋白单用时酶活力之和,且都显著的高于对照。     

杠柳新苷P和E对东方粘虫和小地老虎幼虫中肠蛋白酶活性的影响

从杀虫植物杠柳Periploca sepium Bunge根皮中分离得到的杠柳新苷P具有很高的杀虫活性, 为了探索其杀虫机理, 采用经典的昆虫蛋白酶活性测定方法, 比较研究了杠柳新苷P和无杀虫活性的杠柳新苷E对东方粘虫Mythimna separata与小地老虎Agrotis ypsilon 6龄幼虫中肠类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶活性的影响。结果表明： 对东方粘虫弱碱性类胰蛋白酶, 杠柳新苷P表现出强激活作用（酶活性为对照的3.43倍）, 激活时间可长达8 h, 而杠柳新苷E则无明显激活作用。杠柳新苷P和E对东方粘虫弱碱性类胰蛋白酶活性的影响二者差异显著（P=0.01）, 杠柳新苷P药后2, 4和8 h, 东方粘虫中肠弱碱性类胰蛋白酶的活性分别是杠柳新苷E药后的15.4, 106.8和242.7倍。酶活性测定结果还表明, 与东方粘虫相比, 小地老虎中肠类胰蛋白酶活性相对较低, 且杠柳新苷P的激活作用也较弱, 这可能是杠柳新苷P对东方粘虫具杀虫活性, 而小地老虎对其不敏感的原因之一; 另外, 杠柳新苷P和E对试虫中肠类凝乳胰蛋白酶活性均无明显影响。据此推测, 杠柳活性成分新苷P对东方粘虫中肠弱碱性类胰蛋白酶的激活作用可能是造成试虫中毒的机理之一。     

杠柳杀虫组分F3-28对东方粘虫和小地老虎幼虫中肠消化酶活性的影响

F3-28是从杀虫植物杠柳Periploca sepium Bunge根皮中分离的一个具有杀虫活性的馏分,其主要成分为杠柳苷A、杠柳苷E和杠柳苷X。为了探索F3-28的初始作用部位, 为深入研究其作用机理奠定基础, 本研究采用经典的昆虫消化酶活性测定方法, 比较了F3-28对小地老虎Agrotis ypsilon和东方粘虫Mythimna separata 5龄幼虫消化酶系活性的影响。结果表明：对F3-28不敏感的小地老虎幼虫摄食F3-28后,其中肠蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶的活性无显著变化。对F3-28敏感的东方粘虫幼虫摄食F3-28后2,4,8,10,12,24,48 h, 其中肠总蛋白酶活性分别为对照组的0.76,2.53,1.45,1.88,1.54,1.46,1.70倍,且和药物浓度呈依赖关系; 类胰蛋白酶的活性分别为对照组的1.60, 1.75,1.60,1.12,1.39,1.16,1.15倍（以BAPNA为底物）或1.68,1.95,1.53,1.26,1.15,1.13,1.14倍（以TAME为底物）,且和药物浓度呈依赖关系; 类胰凝乳蛋白酶活性分别为对照组的0.50,1.66,1.44,1.18,1.54,1.08和1.03 倍,但和药物浓度无依赖关系; 淀粉酶的活性分别为对照组的1.60,1.35,1.27,1.31,1.23和1.20 倍,但和药物浓度无依赖关系;对脂肪酶活性无明显影响。这些结果说明,杠柳杀虫活性组分F3-28的作用机理可能涉及对试虫中肠蛋白酶的激活,特别是对类胰蛋白酶的激活。     

Entomotoxic properties of Dioclea violacea lectin and its effects on digestive enzymes of Anagasta kuehniella (Lepidoptera)

Entomotoxic plant lectins have been extensively studied in the past two decades, yet the exact mechanisms underlying their toxic effects remain unknown. This study investigated the effects of Dioclea violacea lectin (DVL) on larval development in Anagasta kuehniella. Chronic exposure of larvae (from neonates to the fourth instar) demonstrated that DVL interfered with larval growth, retarding development and decreasing larval mass without affecting survival. DVL decreased trypsin-like, chymotrypsin-like, and α-amylase activities and proved resistant to proteolysis by midgut proteases up to 24 h. Shorter exposures to dietary DVL had no effect on midgut enzyme activity. Feeding fourth-instar larvae with fluorescently-labeled DVL revealed lectin binding to the peritrophic membrane.     

The interactions between soybean trypsin inhibitor and delta-endotoxin of Bacillus thuringiensis in Helicoverpa armigera larva

No significant difference in larval mortality was observed when a sublethal dose of Bacillus thuringiensis (Bt) var. kurstaki HD-1 crystal was supplemented with soybean trypsin inhibitor (STI) in the artificial diet fed to Helicoverpa armigera in the laboratory, but supplementing a nonlethal dose of crystal with STI in the diet led to a pronounced reduction of larval growth. This concentration of crystal and two lower concentrations of STI alone had no significant effects on larval growth. The results of substrate-gel electrophoresis demonstrated that the proteases in the H. armigera midgut fluid responsible for the degradation of protoxin consisted of at least four proteases with molecular weights of 71, 49, 36, and 30 kDa. All four proteases could utilize casein also as the substrate. When larvae were fed with STI or Bt + STI, the proteolytic activities of the 49-kDa enzyme disappeared, and the activities of the other three enzymes were reduced. Enzyme assays also indicated that feeding larvae with diets containing Bt, STI, or Bt + STI significantly decreased the specific activities of larval general proteases and the trypsin-like enzyme. The protein concentration of midgut fluid was elevated, especially in the larvae fed on the diets containing STI and Bt + STI. Both in vitro and in vivo studies showed that the degradation of protoxin and toxin could be inhibited by soybean trypsin inhibitors, but when the incubation time was prolonged, the protoxin could be degraded completely, while the degradation of toxin was inhibited further. This suggested that the retention time of toxins in the larval midgut was extended and synergism between insecticidal crystal protein and soybean trypsin inhibitor occurred, which showed as the inhibition of H. armigera larval growth.