耐辐射奇球菌crtⅠ基因缺失突变株的构建及其功能研究

利用PCR方法和体内同源重组技术,对耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans)中控制色素合成的关键基因--crtⅠ进行缺失突变,成功获得红色色素缺失突变株M61.对突变株分别进行不同剂量电离辐射(IR)和不同浓度过氧化氢(H2O2)处理,结果表明与野生型菌株R1相比,突变株M61对电离辐射的抗性降低;对过氧化氢的敏感性明显上升,在高浓度H2O2条件下表现异常敏感.HPLC分析结果显示,crtⅠ基因的完全缺失对色素合成途径产生重要影响,导致番茄红素和其他红色类胡萝卜素的合成被抑制.证明crtⅠ基因是耐辐射奇球菌中控制红色类胡萝卜素合成的一个关键基因.为阐明耐辐射奇球菌中类胡萝卜素参与的抗辐射和抗氧化机制奠定了一定基础,为进一步研究类胡萝卜素在耐辐射奇球菌中的合成途径及功能提供了思路.     

耐辐射奇球菌crtI基因缺失突变株的构建及其功能研究

利用PCR方法和体内同源重组技术,对耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans)中控制色素合成的关键基因———crtI进行缺失突变,成功获得红色色素缺失突变株M61。对突变株分别进行不同剂量电离辐射(IR)和不同浓度过氧化氢(H2O2)处理,结果表明:与野生型菌株R1相比,突变株M61对电离辐射的抗性降低;对过氧化氢的敏感性明显上升,在高浓度H2O2条件下表现异常敏感。HPLC分析结果显示,crtI基因的完全缺失对色素合成途径产生重要影响,导致番茄红素和其他红色类胡萝卜素的合成被抑制。证明crtI基因是耐辐射奇球菌中控制红色类胡萝卜素合成的一个关键基因。为阐明耐辐射奇球菌中类胡萝卜素参与的抗辐射和抗氧化机制奠定了一定基础,为进一步研究类胡萝卜素在耐辐射奇球菌中的合成途径及功能提供了思路。     

促DNA修复多效蛋白诱导因子pprI逆转录病毒载体系统的构建及其鉴定

目的:为实现耐辐射球菌pprI基因在哺乳动物细胞中的稳定遗传与表达,构建重组逆转录病毒载体质粒pLXIN-pprI。方法:将目的基因pprI亚克隆经过双酶切后定向连接到pLXIN质粒上,构建逆转录病毒重组质粒pLXIN-pprI。将pLXIN-pprI转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,氨苄青霉素筛选后抽提获得重组质粒pLXIN-pprI,双酶切及DNA测序鉴定。结果:酶切鉴定及测序结果显示结果与预期相符,pprI基因成功插入pLXIN逆转录病毒载体中。结论:重组逆转录病毒载体质粒pLXIN-pprI构建成功,为实现耐辐射球菌pprI基因在哺乳动物细胞中的重组与表达奠定了基础。     

耐辐射球菌辐射耐受机制的研究进展

耐辐射球菌(Deinococcus radiodurans,Dr)是迄今为止地球上发现的最具辐射抗性的生物之一,对紫外线、干旱和诱变剂等损伤因子均表现出极强的抗性,备受世界各国科学家的广泛关注。目前关于其抗辐射机理已有大量的文献报道。根据国内外最新的研究成果,从DNA损伤修复机制、抗氧化防御系统、特殊的生存方式及细胞净化系统等方面,对耐辐射球菌辐射抗性机理的研究进行了简单的概述,并对未来Dr耐辐射机制的研究趋势进行了展望,以期为进一步研究该菌的辐射耐受机制奠定基础。     

耐辐射奇球菌辐射损伤修复机制的研究进展

耐辐射奇球菌是迄今为止发现的对辐射抗性最强的原核生物,是研究DNA损伤与修复的模式生物.耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans,DR)对于电离辐射、紫外线、干燥、H2O2以及其他一些DNA损伤剂均表现出极强的抵抗能力,对于这种超强抗性的具体机制,学界至今尚未形成定论.对DR DNA损伤修复机制的解释包括切除修复和重组修复.本文就耐辐射奇球菌DNA辐射损伤后修复机制的研究进展作一综述.     

新生隐球菌酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定

目的构建新生隐球菌H99细胞酵母双杂交cDNA文库,为后续深入研究新生隐球菌的蛋白功能以及病原-宿主相互作用机制奠定基础。方法提取对数生长中期的隐球菌细胞mRNA,以5’端标记有Oligo dT primer为引物反转录,合成双链后连接Adapter。分级纯化后,通过BP重组反应构建入门文库,入门文库扩增后提取质粒,通过LR重组反应转化为表达文库。结果入门文库总容量为1.13×10~7 CFU,阳性率为90.63%。表达文库总容量为1.25×10~7 CFU,阳性率100%。结论构建的表达文库具有较高的质量,此文库可用于研究新生隐球菌的蛋白互作机制,筛选与宿主蛋白相互作用的隐球菌蛋白,为新生隐球菌的分子致病机制研究奠定基础。     

基于β-半乳糖苷酶为报告基因的耐辐射异常球菌启动子检测载体构建

耐辐射异常球菌是一种超强电离辐射抗性的微生物,其含有大量的胁迫反应相关蛋白及其转录调控因子,在适应环境变化和各种胁迫反应中发挥着重要作用。为深入分析该菌的抗逆基因在不同胁迫下的功能,以β-半乳糖苷酶为报告基因构建了耐辐射异常球菌启动子检测体系。以耐辐射异常球菌基因组为模板扩增gro EL、hsp20、relA和relQ启动子片段,将其连接到到大肠杆菌-耐辐射异常球菌穿梭载体pRADZ1上,构建成具有启动子活性检测功能的重组质粒pRADZ-P_(groE)、pRADZ-P_(hsp20)、pRADZ-P_(relA)和pRADZ-P_(relQ),并将其转化至耐辐射异常球菌,测定β-半乳糖苷酶酶活。结果显示,这些启动子能在耐辐射异常球菌中启动Lac-Z报告基因的表达,并受到胁迫条件的诱导调控。耐辐射异常球菌启动子活性检测方法构建为该菌株特异性胁迫应答系统的研究提供了重要的实验基础。     

Toll样受体5激动剂CBLB502-Fc融合蛋白的表达纯化及初步鉴定

目的:构建Toll样受体5激动剂CBLB502-Fc融合蛋白的真核表达载体,并在CHO细胞中表达,纯化得到具有生物学活性的目的蛋白。方法:首先从合成的pUC57-CBLB502质粒中扩增出CBLB502基因片段,酶切后克隆至pUC57-Fc质粒中,然后双酶切pc DNA3.1和pUC57-CBLB502-Fc,将CBLB502-Fc基因片段克隆至载体pc DNA3.1,挑选阳性克隆并测序,再将重组质粒转染CHO细胞,筛选高表达细胞系,用免疫印迹鉴定表达情况,Protein A亲和柱纯化目的蛋白,SDS-PAGE鉴定目的蛋白,用小鼠辐射试验初步验证目的蛋白的生物学活性。结果:构建了pc DNA3.1-CBLB502-Fc真核表达载体;转染CHO细胞,筛选得到CBLB502-Fc高表达细胞系,并经免疫印迹鉴定培养上清;纯化得到较高纯度的融合蛋白并经SDS-PAGE鉴定;小鼠辐射实验表明CBLB502-Fc具有抗辐射作用。结论:真核表达并纯化了具有抗辐射作用CBLB502-Fc融合蛋白,为后续研究CBLB502-Fc的生物学功能奠定了重要基础。     

耐辐射球菌基因DRB0099缺失突变株的构建及逆境分析

耐辐射球菌(Deinococcus radiodurans R1)有着极强的辐射抗性.研究其抗辐射的机理对于处理放射性废料有着潜在的应用价值.在耐辐射球菌的基因组中,许多序列的功能未知.其中DRB0099尤为引人注意.将DRB0099缺失突变构建该基因的突变株.对野生型和突变体进行比较后发现,在正常生长条件下的前期阶段(0～16 h),突变体生长速度比野生型慢.16 h以后,野生型逐渐进入稳定生长期.这时,突变株的生长速度高于野生型.但是,野生型的浓度一直高于突变株.表明在DRB0099被删除后,耐辐射球菌的生长可能受到了阻滞.在紫外线照射的条件下,尽管野生型随着照射剂量的增加,存活率越来越低,但是要比突变体高许多.野生型具有比突变体更强的修复DNA双链断裂的能力.DRB0099可能直接参与了对DNA的修复.突变体对H2O2的敏感程度高于野生型,表明野生型耐辐射球菌在对抗活性氧保护其蛋白质、DNA或者DNA修复方面具有比突变体更强的功能.在低浓度H2O2处理条件下,尽管野生型和突变体的存活率都出现下降趋势,但二者的差值并不大.随着H2O2剂量的增加,二者的差值越来越大.表明随着活性氧浓度的增加,蛋白质和DNA损伤的数量增加,失去DRB0099基因功能的突变体比野生型更容易受到损伤.在紫外线照射处理或者H2O2处理条件下,DRB0099能够保护蛋白质和DNA.     

耐辐射球菌转录因子DdrO 的基因克隆与生物信息学分析

目的:克隆耐辐射球菌ddrO基因,并对其进行生物信息学分析,预测其功能。方法:根据耐辐射球菌ddrO基因序列,由Primer Premier 5设计一对引物,以提取的耐辐射球菌基因组为模板,PCR扩增获得耐辐射球菌ddrO基因,序列测定并利用生物信息学软件对ddrO基因的理化性质、高级结构及生物学功能等进行分析与预测。结果:成功获得了ddrO基因。生物信息学分析发现,ddrO基因核苷酸序列长度为396bp,编码一个131aa组成的相对分子质量为14.993kD的预测的DdrO转录因子。核酸同源性搜索及比较分析仅在与耐辐射球菌同属的Deinococcus geothermalis和Deinococcus deserti中发现高度相似的序列;蛋白同源性搜索发现一些与DdrO显著同源的蛋白,如Deide₂0570（95%）,Dgeo₀336（90%）,Deide₃p02170（82%）等;结构域分析发现DdrO含有HTH（helix-turn-helix）DNA结合结构域。结论:根据生物信息学结果预测DdrO蛋白可能具有转录调控作用,参与DNA修复和复制,在耐辐射球菌的DNA损伤修复过程中发挥一定作用。