真核生物核酸外切体(exosome)的研究进展

RNA的加工和降解是调控基因时空表达的重要步骤,在调节生物体的生长和发育过程中起着至关重要的作用.几乎所有的RNA都是从一条长的前体加工处理而来,形成成熟的RNA发挥功能,之后进行降解.RNA的降解需要5′-3′核酸外切酶、3′-5′核酸外切酶及核酸内切酶的参与.在真核细胞中,部分3′-5′核酸外切酶所进行的RNA降解依赖于一种称为核酸外切体(exosome)的复合物.该复合物由9个核心蛋白亚基组成,已有的证据表明,其广泛参与了动物、酵母及植物体中多种RNA的加工和降解过程.本文综述了真核生物中核酸外切体的研究进展,讨论了该复合体在RNA加工降解过程中的作用机制.     

博莱霉素-Ce(Ⅲ)对DNA的切断机理初探

根据外切核酸酶Ⅲ酶解博莱霉素-Ce(Ⅲ)［BLMA5-Ce(Ⅲ)］作用过的双链直线型DNA时, 酶解速率明显增大, 酶解产物除5′-dAMP、5′-dGMP、5′-dCMP和5′-dTMP 4种单核苷酸外, 还有其他成分存在的实验事实, 推测出BLMA5-Ce(Ⅲ)在DNA双链的特定部位沿5′→3′的方向切断磷酸二酯键, 使DNA的双链上形成多个暴露的3′-OH末端.     

Sulfolobus acidocaldarius DHH超家族核酸酶Saci0542的酶学特征研究

【目的】以嗜酸嗜热硫化叶菌Sulfolobus acidocaldarius的DHH超家族核酸酶（Saci0542）为例,研究其核酸外切酶活性特点,为阐明其在DNA代谢中的具体功能提供生化基础。【方法】将嗜酸嗜热硫化叶菌DHH超家族核酸酶Saci0542基因在大肠杆菌中重组表达,经亲和层析纯化得到电泳纯的重组蛋白;利用荧光标记的寡核苷酸作为底物,用尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,鉴定Saci0542的酶学特征。【结果】重组表达的DHH超家族核酸酶Saci0542具有典型的单链核酸特异性的3’-5’外切酶活性。进一步酶学特征表征结果如下:酶活性依赖于二价金属离子Mn²⁺,而Ca²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺等二价金属离子对活性没有明显的促进作用;Saci0542在pH5.5–10的广泛范围内均表现出较高酶活性;高于200 mmol/L的NaCl强烈抑制酶活性;最适反应温度为50–55℃;末端磷酸基团抑制3’-5’外切酶活性。【结论】本研究证实,Saci0542是一种Mn²⁺依赖型3’-...     

嗜热古菌Archaeoglobus fulgidus RecJ核酸酶的表达纯化及酶学特征

【目的】克隆表达嗜热古菌Archaeoglobus fulgidus (A.fulgidus)来源的RecJ核酸酶基因(ORF编号AF_0699,NCBI数据库基因登陆号为AF_RS03550),对该重组蛋白的核酸酶活性及酶学特征进行鉴定和分析。【方法】将A.fulgidus RecJ (AfuRecJ)核酸酶在大肠杆菌中进行重组表达,经亲和层析纯化得到电泳纯蛋白;利用人工合成的带有末端荧光标记的寡核苷酸作为底物,体外反应后,利用8 mol/L尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定AfuRecJ核酸酶的水解产物。【结果】AfuRecJ核酸酶具有单链DNA特异性的3’–5’外切核酸酶活性,酶活性依赖于二价金属离子Mn2+或Mg2+,且Mn2+存在条件下的催化效率明显优于Mg2+;其最适反应温度范围为55–65℃;高于200 mmol/L的NaCl会显著抑制AfuRecJ的核酸酶活性。AfuRecJ还具有单链RNA 3’–5’外切酶活性,且活性高于单链DNA底物。单链核酸3’末端的磷酸基团对水解活性有一定抑制作用。AfuRecJ对单链核酸的长度有一定的选择性,可以有效水解长度≥4个核苷酸长度的单链RNA、≥12个核苷酸长度的单链DNA,而且对双链DNA中的3’单链DNA结构(3’突出单链尾巴与末端分叉结构)具有类似单链DNA的水解活性。【结论】本研究证实AfuRecJ是一种单链核酸特异性的3’–5’外切核酸酶,且相比单链DNA,单链RNA为优势底物,推测其在胞内可能参与RNA降解与DNA修复。     

Exosome的功能及作用机制的研究进展

Exosome（外切酶体）是一种包含了至少10种必要组分的蛋白复合,它在真核细胞RNA加工和mRNA3′→5′方向降解过程中都起重要的作用,近两年来,Exosome还被发现在mRNA的质量控制和5′端去帽中起关键作用,随着对mRNA的AREs功能研究的进一步深入和ski复合物的发现,人们对Exosome作用机制的认识取得了突破性进展。     

外切纤维素酶的研究与应用进展

纤维素酶主要包括三大类：外切纤维素酶、内切纤维素酶和β-葡萄糖苷酶。其中,外切纤维素酶因具有活性高、耐受性好、来源广等特点而被广泛应用于各种工业生产中。基于此,主要阐述了外切纤维素酶的分类、来源以及生化特性,介绍了外切纤维素酶的筛选及其水解产物分析的相关新技术,并综述了其在造纸业、食品加工业、制药业、纺织业、能源再生等工业领域中的应用进展,以期推动外切纤维素酶的深入研究及工业化应用。     

DNA末端构型调控RecJ核酸外切酶活性

目的 核酸酶介导的DNA双链末端切割对同源重组修复至关重要。然而,DNA末端构型对RecJ 5’-3’核酸外切酶活性的调控尚不清楚。本研究旨在探究DNA3’端和5’端构型对RecJ核酸外切酶活性的影响及其机制。方法 为探究DNA3’端构型对RecJ核酸外切酶活性的影响,使用含有Mg²⁺的体系,对具有不同3’突出末端长度（9 nt与18 nt）和3’突出末端修饰（磷酸化和硫代磷酸酯修饰）的单链DNA分别进行RecJ核酸酶活性检测。为揭示DNA 3’端构型对RecJ外切酶活性的调控机制,在Mg²⁺缺失的体系中,使RecJ与底物结合后进行凝胶迁移实验（EMSA）。为探索其他调控因子与DNA3’端构型对RecJ的协同作用,分别检测5’端磷酸化修饰和单链DNA结合蛋白（SSB）对DNA3’突出末端修饰的影响。结果 DNA3’端构型包括突出末端的长度和修饰（磷酸化和硫代磷酸酯修饰）均会抑制RecJ外切酶活性。DNA 3’端磷酸化和硫代磷酸酯修饰通过重塑RecJ-DNA的结合模式抑制RecJ外切酶活性。DNA 5’端磷酸化修饰可增强RecJ对具有不同3’端...     

miRNA的异构体——isomiR

最近,深度测序技术揭示:同一个miRNA前体可能由于Drosha或Dicer的剪切位点改变,外切核酸酶介导的miRNA末端缩短,miRNA编辑或miRNA 3'末端无需模板的核苷酸添加等4种原因,而形成多种长度或序列不同的miRNAs异构体—isomiR.因为这些isomiR与已注解的miRNA可以调节同一个靶标,也可以靶向不同的靶标,所以它们不仅扩大了miRNA调节的范围,而且还有可能代表了每种miRNA基于isomiR的一种微型调节网络.研究发现,isomiR的表达具有细胞、组织、发育和疾病状况等特异性,并且很多人类疾病的致病机制也与它们有关,推测isomiR将来不仅有可能成为疾病诊断或治疗的生物学标记或靶标,而且相关的研究还对于RNA干扰技术也具有重要的指导意义.本文主要综述了isomiR的研究进展,并对isomiR应用前景做了展望.     

寡聚脱氧核苷酸的结构与抗降解特性的研究

合成了４段具有不同高级结构或不同修饰的寡聚脱氧核苷酸,检查它们在２０％血清中的稳定性．发现：（１）寡核苷酸主要被血清中的３′外切核酸酶降解,未经修饰的线性寡核苷酸降解严重;（２）末端部分硫代修饰的寡核苷酸稳定性明显提高;（３）自身互补形成的配对结构可有效保护３′末端．具有４个以上（含４个）ＧＣ对的３′端发夹结构寡核苷酸,其抗核酸酶的能力几乎与硫代修饰的寡核苷酸相当．     

E.coli外切核酸酶Ⅲ的提取和纯化

E.coli外切核酸酶Ⅲ(EXOⅢ)有四种功能。第一,从双链DNA 3’端向5’端逐个水解磷酸二酯键,释放出5’-单核苷酸,因此是3’→5’的外切核酸酶。第二,水解DNA的3’末端磷酸单酯键,释放出无机磷酸。第三,它可以在DNA无嘌呤区段上水解磷酸二酯键,因而又是无嘌呤或无嘧啶内切核酸酶。最后,对